前列腺癌的生物学标志物、治疗靶点及其用途制造技术

提供一组前列腺癌的生物学标志物，其中生物学标志物包括融合基因、长链非编码RNA、基因突变和选择性剪切体。还提供这些生物学标志物在作为诊断前列腺癌的试剂或者治疗前列腺癌的药物的靶点中的用途。

【技术实现步骤摘要】
前列腺癌的生物学标志物、治疗靶点及其用途相关申请本申请是申请日为2011年9月16日、名称为《前列腺癌的生物学标志物、治疗靶点及其用途》的中国专利申请201180073445.7的分案申请。
本专利技术涉及癌症领域，特别是前列腺癌。同时，本专利技术涉及使用下一代测序技术，以寻找用于诊断、预后和治疗反应预测的生物学标志物和有效治疗前列腺癌的药物靶点，特别是用于前列腺癌的生物学标志物。本专利技术中，特别使用了RNA-Seq技术，即转录组测序技术分析前列腺癌组织和癌旁正常组织的转录组，揭示中国人前列腺癌完整的转录图谱。
技术介绍
在发达国家，前列腺癌仍是发病率最高的肿瘤，同时在男性癌症相关死亡中排第二位。全世界前列腺癌的发病率在不断上升，但在不同国家和种族中，其发病率差异很大。发病率最高的是西方国家，如美国；发病率最低的是东亚国家，如中国，这种差异可能部分是由不同种族的基因差异引起的。此外，前列腺癌是一种异质性疾病。每一个肿瘤在肿瘤进化以及生物学行为(如肿瘤休眠，局部生长，远处扩散，对治疗的反应以及复发等)上差异很大。因此，组织病理学分级分期以及Gleason评分相同、治疗方案相同的病人，其临床结局以及肿瘤进展史可能截然不同。有的病人其肿瘤处于休眠状态、局限于前列腺，可以生存10年以上，而其他病人却在诊断后2-3年死于肿瘤的远处转移。种种证据表明，前列腺癌临床行为的异质性是在肿瘤进展过程中由其内在的分子机制差异引起的。在过去的十余年间，DNA和RNA芯片技术在分析生物学机制上应用广泛。其帮助我们对前列腺癌的发病机制有了新的了解，为我们找到用于诊断、预后和治疗反应预测的生物学标志物提供了基础。虽然目前为止，类似乳腺癌的OncotypeDx和MammoPrint的用于前列腺癌基因组预后检测极少，但一些被发现的前列腺癌分子学改变正在被应用于临床实践。Taylor等(TaylorBS,etal.(2010)Integrativegenomicprofilingofhumanprostatecancer.CancerCell18(1):11-22.)通过对前列腺癌的综合基因组分析发现，某些基因拷贝数的变化可能区分进展性肿瘤和休眠性肿瘤，该发现意义重大。然而，我们仍迫切需要新的生物学标志物以更准确地检出前列腺癌并改进对肿瘤进展性及治疗结局的预测能力。需要指出的是，虽然以基因芯片为基础的研究对我们对人类肿瘤发生发展的理解做出了重大贡献，但该技术有很大的局限性，如不能检测基因组结构的变化和碱基突变。
技术实现思路
在过去几年中，下一代测序技术(NextGenerationSequencing,NGS)的飞速发展克服了上述不足。NGS使我们能以前所未有的高分辨率和高通量分析整个肿瘤基因组及转录组。NGS的数据能从多个角度分析基因组，如突变，转录，结构变异和转录后调节(如甲基化)。此外，NGS技术的不断改进使得科学家能够对主要的肿瘤类型的基因组进行测序。目前，几乎所有针对前列腺癌基因组和转录组水平变化的研究都是在白人中进行，黄种人的研究极少。在本研究中，我们用RNA-Seq技术，即转录组测序技术分析了14对前列腺癌组织和癌旁正常组织的转录组。我们将所有的转录产物类型进行分析，揭示中国人前列腺癌完整的转录图谱。我们找到了很多异构体包括：外显子跳跃、内含子保留、5’和3’端选择性剪切、基因融合、点突变、长链非编码RNA，这些都可能在前列腺癌的发生和发展中起作用。我们的研究阐明了前列腺癌基因组变化的复杂图谱，证实了前列腺癌的异质性，推进了我们对中国人前列腺癌的认识。1.前列腺癌新型融合基因的发现和验证(1).对上海长海医院14对前列腺癌和癌旁组织中进行RNA-Seq(即转录组测序技术)，发现USP9Y-TTTY15、CTAGE5-KHDRBS3、RAD50-PDLIM4、SDK1-AMACR共4个文献未报道高频融合基因及其它数十个融合基因，参见如下表1。表1.前列腺癌新型融合基因(2).我们在54对前列腺癌和癌旁组织中对这些融合基因进行了验证。我们设计了基因融合特异性的PCR引物。PCR和琼脂电泳后，所有RT-PCR扩增片段割胶回收(QiagenQIAquickGelExtractionkit)并行Sanger测序。我们发现验证的4个新型融合基因在癌组织中特异表达、频率较高(结果见图2－4)。这些融合基因之前未被报道过，但其在本研究中频率较高提示其在中国人前列腺癌的发生中起重要作用，这些可望在后续的研究中得到阐明。(3).临床应用前景：在癌组织中表达，癌旁和正常组织中不表达的融合基因，是高度特异性的前列腺癌标记物，在血液、尿液中通过realtimePCR检测，前列腺穿刺组织和术后组织通过FISH检测融合基因存在情况，用于前列腺癌病人的早期诊断、分子分型和判断病人预后，同时融合基因可作为靶向治疗的靶点。2.发现差异性表达的长链非编码RNA前列腺癌中长链非编码RNA的转录图谱。越来越多的证据表明长链非编码RNA在细胞生物学许多方面中起作用，提示其在疾病的病因学，包括肿瘤发生机制中起作用。到目前为止，之前的研究都未涉足肿瘤中长链非编码RNA的整体转录水平改变。因此，我们首先在前列腺癌组织及其配对癌旁正常组织中分析了长链非编码RNA的整体转录谱，发现每个标本中平均有1599个已知长链非编码RNA表达。接下来，我们在前列腺癌组织和配对癌旁正常组织比较了长链非编码RNA的表达水平，发现平均有406个长链非编码RNA在二者间有差异性表达(倍数改变>＝2，假阳性率,FalsepositiveRate,FDR<＝0.001)，其中137个长链非编码RNA在50％的前列腺癌中都呈现一致的上调或下调。因为大多数长链非编码RNA被发现与转录调节有关，我们研究了长链非编码RNA表达量的变化对前列腺癌基因表达的影响。我们分析了每个长链非编码RNA与所有基因表达量的相关性。使用绝对相关系数大于0.85、假发现率小于0.01为界值，我们发现与长链非编码RNA高度相关的基因。非常有趣的是，有23个长链非编码RNA与全基因组中数百个基因显著相关，而其他大多数基因仅与几个基因相关，或者根本就不相关。这提示长链非编码RNA可能有转录调节以外的功能，比如在转录后水平的调节。出人意料的是，除了两个长链非编码RNA外，几乎所有的长链非编码RNA与基因表达呈正相关，提示这些长链非编码RNA可能促进基因的表达。为了研究长链非编码RNA与前列腺癌的关系，我们选择了4个长链非编码RNA(两个已知：DD3和MALAT1；两个新发现：FR257520和FR348383)，并用qRT-PCR在两组前列腺标本中检测它们的表达量。第一组是40对前列腺癌组织及其配对癌旁正常组织，第二组是15个正常人前列腺组织和15个前列腺癌组织。qRT-PCR和RNA-seq结果有很强的相关性。与RNA-Seq结果一致，在大多数前列腺癌标本中PCA3、MALAT1和FR348383过表达，而FR257520表达量降低。PCA3过表达的结果与之前认为其可能成为新的诊断标志物的研究类似，但我们首次发现MALAT1、FR257520和FR348383在前列腺癌中表达与正常前列腺有明显差异。临床本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于前列腺癌的生物学标志物，其包括融合基因CTAGE5‑KHDRBS3。

【技术特征摘要】
1.用于扩增前列腺癌的生物学标志物融合基因CTAGE5-KHDRBS3的引物，其特征在于，所述引物的核酸序列如下所示：正向引物：TGCTGAAAATGAAGCCACTG；反向引...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙颖浩，彭智宇，任善成，易康，毛建华，张纪斌，
申请(专利权)人：上海长海医院，深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31