一种同时检测水中狗、猪、鸡粪便污染的PCR试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测水中狗、猪、鸡粪便污染的PCR试剂盒及其检测方法，属于水体粪便污染检测领域。一种同时检测水中猪、狗、鸡粪便污染的试剂盒，包括引物、dNTP、PCR buffer、Mg2+溶液和ddH20，利用该试剂盒检测水体粪便污染方法如下：提取待测水样DNA，以其为DNA为模板，利用试剂盒中提供的引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg2+溶液和ddH20进行PCR扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察，若出现390bp、490bp、和783bp的条带，则分别对应指示水中存在狗、猪、鸡粪便污染。该试剂盒可准确检测到水中单独存在或随机组合存在的狗、猪、鸡粪便污染，最多可同时检测到以上三种粪便污染，在排查粪便污染源时，可在很大程度上节省检测时间和费用，具有较高的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水体污染检测领域，更具体地说，涉及一种同时检测水中狗、猪、鸡粪 便污染的PCR试剂盒及其检测方法。
技术介绍
近年来，随着人口和经济的增长，水体污染情况日趋严重，其中粪便污染尤为突 出。粪便污染物进入水体后不仅会增加水体氮磷含量，造成水体富营养化，并且会带入粪 便中可能存在的致病菌，引发疾病的水体传播（Baldursson S and Karanis P. Waterborne transmission of protozoan parasites:Review of worldwide outbreaks - An update 2004 -2010. Water Research 2011 ;45(20):6603 -6614.)。因此进行水体粪便污染防治已 刻不容缓。 粪便污染的潜在污染源种类繁多，畜禽养殖业中的猪、鸡等常见物种的粪便排泄 物，由于缺乏适当的处理，常常被直接排放到环境中，造成水体粪便污染，另外，随着宠物 (尤其是宠物狗）的数量越来越多，其产生的粪便排泄物也成为了水体粪便污染的来源之 一。在点源、面源污染同时存在的情况下，缺乏对粪便污染来源的准确掌握和定位，使得治 理工作职能停留在"见污治污"阶段，在一定程度上增加了污染治理的成本。如何寻找和区 分并快速、准确定位水体中的粪便污染源，成为了解决问题的关键。 传统粪便污染检测方法通过检测水中粪便污染指示菌（如大肠杆菌、肠球菌等） 来判断水体粪便污染情况，耗时长且无法区分污染源。通过检测水体宿主特异性微生物或 化学标志物，可以达到粪便污染溯源的目的，但现存的一些微生物及化学标志物特异性不 高，往往导致假阳性结果的产生。粪便中存在大量来自脱落肠道细胞的线粒体DNA，由于不 同物种的线粒体DNA不同，其中特定片段中存在大量单核苷酸多态位点，使得线粒体DNA 具有种属特异性，可以通过检测受粪便污染水体中的线粒体DNA片段来达到粪便污染溯源 的目的（Caldwell J，Payment P and Villemur R(2011)Mitochondrial DNA as Source Tracking Markers of Fecal Contamination.)〇 以PCR为基础的分子生物学技术的快速发展为水体粪便污染的检测提供了强有 力的工具。但目前常用的基于PCR手段的粪便污染溯源方法通常只能对污染源进行单独 检测（Caldwell JM and Levine JF. Domestic wastewater influent profiling using mitochondrial real - time PCR for source tracking animal contamination. Journal of microbiological methods 2009 ；77 (1):17 - 22. Schill WB and Mathes MV. Real -time PCR detection and quantification of mine potential sources of fecal contamination by analysis of mitochondrial cytochrome b targets. Environmental science&technology 2008 ;42(14) :5229 - 5234.)。目前尚未公开能够区分多种污染源的 检测方法。本专利技术通过比对不同物种的线粒体DNA序列，找到了狗、猪、鸡特异性DNA片段， 并针对不同片段设计了特异性引物，且不同引物的扩增片段长度具有一定差距，使得在一 个PCR反应体系中区猪、狗、鸡三种粪便污染源成为可能。
技术实现思路
1、要解决的问题 目前检测水体粪便污染的PCR方法通常是对潜在污染源进行逐个排查，耗时久且 成本高。针对此问题，本专利技术提供了 一种能够同时检测水体中狗、猪、鸡粪便污染的PCR试 剂盒及其检测方法，可以达到快速、准确排查或检测水体粪便污染源的目的。 2、技术方案 本专利技术的目的通过以下技术方案实现 一种同时检测水中狗、猪、鸡粪便污染的PCR方法及试剂盒，包括引物、Taq酶、 dNTP、PCR buffer、Mg2+溶液和ddH20,其中引物包括：引物 1 :5' -CTGTGCTATGTCAGTATCTCCAG- 3'； 引物 2 :5' -GGCTGATTAGTCATTAGTCCATCG- 3'；引物 3 :5' -CTACTCATACCCAGCAAGCC- 3'；引物 4 :5' -TAGGAATTAATAGGGCGGGTG- 3' ；引物 5 :5' -CACATGTTATCTGCACCAGC- 3'；引物 6 :5' -GTTAAGGGTACGAGTTTGTCG- 3'。更进一步的，所述 PCR buffer 为 10XPCR buffer，dNTP 浓度为各 2. 5mmol/L，Taq 酶浓度为5U/ul，Mg2+溶液浓度为25mmol/L。。 采用上述PCR试剂盒的检测水体粪便污染的方法，具体步骤如下：提取待测水样 DNA，以待测水样DNA为模板，利用上述试剂盒中提供的引物1 -6、dNTP、PCR buffer、Mg2+溶 液和ddH20进行PCR扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察条带存在情况， 以此判断水体粪便污染情况。 具体的，利用上述试剂盒检测水体粪便污染的方法为： (1)提取水样 DNA; ⑵以水样DNA为模板，利用试剂盒中提供的引物、dNTP、PCR buffer、Mg2+溶液 和 ddH20 进行 PCR 扩增，反应体系为：5ul 的 10XPCR buffer;5ul dNTP;0.25ul Taq 酶； 4ul Mg2+;3ul的混合引物1 - 6,其中每个引物的浓度均为10um〇l/L ;4ul模板DNA ;灭菌 ddH20 补足至 50ul ;反应条件为 95°C，预变性 5min ;95°C 30s，59°C 30s，72°C 45s，40 个循环； 72°C 7min，4°C 保存； (3)检测PCR扩增产物：将5ul PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，1XTAE作为电 泳仪，EB染色，电泳条件为电压80V，电流400mA，时间25min。（4)电泳结束后在紫外灯下 观察凝胶；凝胶上出现的390bp、490bp、和783bp的条带，分别对应指示狗、猪、鸡粪便污染。 更进一步的，本试剂盒可检测到水体中单独存在或随机组合存在的狗、猪、鸡粪便 污染，最多可同时检测到以上三种粪便污染。 3、有益效果 相比于现有技术，本专利技术的优点在于可在一次PCR反应中同时检测狗、猪、鸡三种 粪便污染，可检测到水体中单独存在或随机组合存在的狗、猪、鸡粪便污染，对于粪便污染 情况较复杂的水体，可达到尽快排除或确定粪便污染源的目的，节约时间和成本。 本专利技术选取的污染标志物为不同动物的线粒体DNA，使得检测方法具有良好的特 异性，电泳检测时不同动物粪便对应的条带分离较清晰，能够准确判断不同条带的归属，降 低了检测样品的误判。【附图说明】 图1:本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测水中狗、猪、鸡粪便污染的PCR试剂盒，包括引物、dNTP、PCR buffer、Taq酶、Mg2+溶液和ddH20，其特征在于：所述的引物为混合引物，包括：引物1：5’‐CTGTGCTATGTCAGTATCTCCAG‐3’；引物2：5’‐GGCTGATTAGTCATTAGTCCATCG‐3’；引物3：5’‐CTACTCATACCCAGCAAGCC‐3’；引物4：5’‐TAGGAATTAATAGGGCGGGTG‐3’；引物5：5’‐CACATGTTATCTGCACCAGC‐3’；引物6：5’‐GTTAAGGGTACGAGTTTGTCG‐3’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张徐祥，何席伟，陈慧梅，于红霞，史薇，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32