本发明专利技术公开了一种Ｎｅｕｒｉｔｉｎ蛋白活性片段及其表达系统和专用载体。本发明专利技术的活性片段是如下（ａ）或（ｂ）的蛋白质：（ａ）由序列表中序列２所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（ｂ）将序列２的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且与序列２具有相同功能的由序列２衍生的蛋白质。本发明专利技术还提供了含所述活性片段的重组质粒和含有该重组质粒的毕赤酵母重组菌。培养所述毕赤酵母重组菌，进行诱导表达可得到所述活性片段。所述活性片段仅为Ｎｅｕｒｉｔｉｎ蛋白的部分序列，但具有原蛋白的活性。应用本发明专利技术的毕赤酵母表达系统生产Ｎｅｕｒｉｔｉｎ蛋白的活性片段，操作简便、产率高，具有巨大的应用前景和社会意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种Neuritin蛋白活性片段及其表达系统和专用载体。
技术介绍
Neuritin是1993年由Nedivi发现(Nedivi E， He v皿i D， Naot D， et al. Numerous candidate plasticity related genes revealed by differential cDNA cloning. Nature[J]， 1993， 363(24): 718-722)，与神经可塑性相关的神 经营养因子(Naeve GS， Ramakrishnan M， Kramer R, .et al. Neuritin :A gene induced by neural activity and neurotrophins that promotes neuritogenesis. Proc Natl Acad Sci[J]，1997， 94(3): 2648- 2653) 。 Neuritin能促进胚胎期神 经突起的生长及其分支和突触的发育成熟，调节突触回路的形成(Di Giovanni S， Faden AI， Yakovlev A， el. Neuronal plasticity after spinal cord injury: identification of a gene cluster driving neurite outgrowth.. [J] FASEB J.， 2005， 19: 153 - 154);并可抑制神经祖细胞的凋亡，维持神经元的存活(Putz U， Harwell C, Nedivi E. Soluble CPG15 expressed during early development rescues cortical progenitors from apoptosis. [J]Nature Neurosience， 2005 ,8(3) :322-332)。鉴于Neuritin在神经突触可塑性、保护受损神经元和促 进神经再生过程中的重要的作用，其有望成为对神经病变和神经损伤进行治疗的潜 在靶点。由于正常生理情况下，体内天然Neuritin的含量很低，提取与纯化比较 困难，无法满足生物学功能研究和临床应用的需要，因此利用基因工程方法制备大 量Neuritin重组蛋白，成为对Neuritin基础和功能研究的重要途径之一。动物、植物、微生物作为生物反应器，为外源基因的表达提供了理想的环境， 是基因工程及生物制药研究和应用的重要内容。大肠杆菌被誉为外源蛋白质表达的 工厂，特点如下1)具有易操作性、生长速度快、培养条件简单等优势，许 多真核生物基因在大肠杆菌中可以表达；2)由于其表达出的蛋白质多以不溶解的 包涵体形式存在，需要经过菌体破碎、变性及复性等过程，给后续的活性鉴定和功 能研究带来了不便；3)不具有真核生物中mRNA翻译后修饰、加工的场所，表达的 产物往往缺乏天然的生物结构或活性。哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统的特点如下:1) 克服了上述原核表达系统的不足，能够表达结构复杂的分泌性的真核细胞蛋白；2) 操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵，不易广泛推广使用(HeckneyRC. TrendsBiotech ，1994 ,12 (11) :456 463)。酵母作为单细胞低等真核生物，特 点如下1)具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等 特性；2)具有真核生物基因产物正确折叠所需的细胞内环境和糖链加工系统；3) 能分泌外源蛋白到培养液中，便于纯化(3 BruelC ， ChaK， ReevesPJ ， et al. Proc Natl Acad Sci USA ， 2000 ，97(7) : . 3004 3009)。因此，近年来酵母在真核 基因外源性表达中的应用越来越广泛。目前的酵母表达系统包括巴斯德毕赤酵母表达系统、酿酒酵母表达系统、乳酸 克鲁维酵母表达系统、多型汉逊酵母表达系统。毕赤酵母表达系统是近10年来最 成功的外源基因表达系统之一，到目前为止，已经有200多种外源蛋白在此系统中 得到表达(华慧，周思翔，王正荣.外国外医学生物医学工程分册，2003. 26(3) :112 H7)(朱剑昆，许志详，黄伟达，等.中国医学科学院学报,2001 ，23 (2) :127 13D (马翻，王小宁，张智清，等.分子与细胞免疫学，2001 ， 2 :61 65) (官孝群，王跃祥，吴良成，等.生物工程学报，2001 ， 17 (2) :126 130.)(阎锡 蕴，汤健，刁爱坡.微生物学通报，2001 ，28 (1) :48 52)。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris )是甲醇营养型酵母，在缺少葡萄糖的情 况下，以甲醇作为唯一的碳源生长，利用甲醇诱导乙醇氧化酶启动子(AOX)的表达， 在有乙醇氧化酶存在的条件下进一步催化甲醇的代谢，进行重组蛋白质的表达。与 其他表达系统相比，巴斯德毕赤酵母有以下诸多方面的优点①在蛋白质诱导表达 的过程中虽然以甲醇作为唯一的碳源，但不存在细菌、动物细胞培养中的内毒残留 问题(Geoff ， PLin ， Cereghino ， et al. 'Current Opinionin Biotechnology ， 2002 13 :329 332)。②有A0X1和A0X2两个基因编码乙醇氧化酶，其中A0X1基因的 表达主要受较高水平甲醇的诱导和调节，能大幅度提高外源蛋白的产量。③具有真 核生物翻译后的糖基化修饰、折叠、加工和外分泌的环境，在表达蛋白质过程中有 适度的糖基化修饰，使所表达的外源蛋白结构与构象更接近于天然蛋白(Geoff ， PLin ， Cereghino ， et al. Current Opinionin Biotechnology ,2002 , 13 :329 332)。④毕赤酵母表达系统中表达的糖蛋白，其糖链部分经高尔基复合体的进一 步剪切后，不含a-1， 3甘露糖，避免了酿酒酵母中的免疫原性问题，使表达的糖 蛋白更适于治疗用途(熊爱生，彭日荷，李贤，等.生物化学与生物物理学4报，2003，35(2) :154 160)。⑤在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内，又可 分泌至细胞外，而且毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源分泌 蛋白的纯化。⑥许多大肠杆菌中不能表达的蛋白质在巴斯德毕赤酵母中可以得到有 效表达，方便的操作和低廉的成本使其极具市场潜力。尽管应用巴斯《i毕赤酵母表 达外源蛋白具有以上优势，但外源基因在表达过程中受基因内部结构、分泌信号、 甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的pH值等诸多因素的 影响，使外源蛋白的表达随环境条件的变化不稳定，甚至一些蛋白的表达量会很低 或不表达。因此对于某种蛋白质的表达需要根据具体情况，对表达的条件进行分析 和优化。为提高外源性蛋白的表达量，许多学者分别从内在因素和外在条件进行了探索 研究(张惠堂，颜志强，蔡兴锋，杨胜利，龚毅.人睫状神经营养因子在大肠杆菌 和毕赤酵母中的表达和生物活性测定.[J]中国生物化学与分子生物学报.2005 ， 本文档来自技高网...
【技术保护点】
Ｎｅｕｒｉｔｉｎ蛋白的活性片段，是如下（ａ）或（ｂ）的蛋白质： （ａ）由序列表中序列２所示的氨基酸序列组成的蛋白质； （ｂ）将序列２的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且与序列２具有相同功能的由序列２衍 生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1、Neuritin蛋白的活性片段，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。2、 权利要求l所述活性片段的编码基因。3、 根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述活性片段的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子1) 其编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3) 与l)或2)限定的DNA序列具有90。/q以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。4、 含有权利要求2或3所述基因的重组表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔丽娟，黄瑾，黎兴毅，李新丽，罗星，王倩，仙玲玲，杨磊，于娜，张峤，张树军，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：65[中国|新疆]
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