本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及人重组ｃｈｅｍｅｒｉｎ蛋白、重组载体和转化体及其制备方法。本发明专利技术首次公开了人重组ｃｈｅｍｅｒｉｎ蛋白、重组载体和转化体及其制备方法。本发明专利技术所提供的人重组ｃｈｅｍｅｒｉｎ蛋白为直接具有淋巴细胞趋化活性的形式。本发明专利技术所述制备人重组ｃｈｅｍｅｒｉｎ蛋白的方法，工艺简单、成本低廉，不需要酶切等额外的步骤，所生产的重组ｃｈｅｍｅｒｉｎ蛋白产品纯度达到９８％以上，内毒素含量低，活性高。这为ｃｈｅｍｅｒｉｎ蛋白在新药研发和检测试剂的应用提供了丰富的、高质量的原料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及人重组chemerin蛋白、重组载体和转化体及 其制备方法。背景资料chemerin是一种最近被新发现的趋化功能蛋白，为ChemR23配体，最早是从卵巢癌晚 期病人腹腔积水分离纯化出来(Val6rie Wittamer, Jean-Denis Franssen, Marisa Vulcano, et al.， J.Exp. Med. 198 (2003) 977—985.)。人Chemerin基因(GB: NM_002889)长度为734bp， CDS长度为492bp， CDS中前面60bp编码一长度为20氨基酸的信号肽，最后21bp编码 一6氨基酸的C端多肽。其前体蛋白质是由163个氨基酸残基组成，N端的信号肽不包含 在分泌出来的Chemerin前体蛋白内，而Chemerin前体蛋白被血清中的丝氨酸蛋白酶酶切 长度为6氨基酸的C端多肽之后，成为具有生物活性的chemerin。通过与ChemR23结合作用，chemerin对树突状细胞和巨噬细胞迁移具有强大的趋化作 用(Val6rie Wittamer, Jean-Denis Franssen, Marisa Vulcano, et al J. Exp. Med. 198 (2003) 977-985.)。有研究表明chemerin对血中NK细胞具有募集作用(Silvia Parolini, Amerigo Santoro, Emanuela Marcenaro, et al Blood 109 (2007) 3625-3632.)。因此，chemerin作为一 种重要的免疫调控生理因子，被广泛认为是一个新药研究开发的热点。最近研究资料显示， chemerin还是一个非常重要的脂肪因子，肥胖人群的chemerin血清水平明显高于对照组人 群，参与肥胖或糖尿病的发病调控(Takahashi， M. et al FEBS Lett. 582 (5) (2008)， 573-578)， 可作为肥胖或糖尿病的临床检测指标之一。但chemerin在生物体内含量很少，且难以纯化。目前尚无有具有生物活性的人重组 chemerin蛋白报道或上市。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种人重组chemerin蛋白。为此， 一方面，本专利技术公开了一种人重组chemerin蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白质(a) 其氨基酸序列如SEQIDNO.l所述的蛋白质；(b) 在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有淋巴细胞趋化作用活性的由(a)衍生的蛋白质。一方面，本专利技术公开了一种多核苷酸分子，其特征在于该多核苷酸分子编码本专利技术所述人重组chemerin蛋白。在一实施例里，所述多核苷酸分子的碱基序列如SEQ ID N0.2。一方面，本专利技术公开了一种包含本专利技术所述多核苷酸分子的重组表达载体。在实施方式中，所述重组表达载体可为原核表达载体或真核表达载体，其中优选原核表达载体，最优选pET28a质粒。一方面，本专利技术公开了一种包含本专利技术所述重组表达载体的转化体。 在一实施方式中，所述转化体为大肠杆菌。另一方面，本专利技术公开了一种本专利技术所述人重组chemerin蛋白的制备方法，包括如下步骤a) 人重组Chemerin蛋白表达载体的构建；b) 人重组Chemerin蛋白转化体的制备；c) 人重组Chemerin蛋白的表达；d) 人重组Chemerin蛋白的纯化。在一实施方式中，所述人重组Chemerin蛋白表达载体为包含编码本专利技术所示蛋白的 DNA的表达载体，其中所述重组表达载体可为原核表达载体或真核表达载体，优选原核表 达载体，最优选pET28a质粒。在一实施方式中，所述人重组Chemerin蛋白转化体是包含人重组Chemerin蛋白表达 载体的大肠杆菌。人重组Chemerin蛋白表达载体优选为包含编码SEQ ID NO.l所述人重 组chemerin蛋白DNA的表达载体。在一实施方式中，在步骤c)后和步骤d)前，还包括人重组Chemerin蛋白的变性及复性 步骤所述大肠杆菌破菌并收集包涵体，所述包涵体溶解至盐酸胍变性溶液中变性，然后 采用复性液复性人重组Chemerin蛋白，其中复性液为Tris-HC1缓冲液并含有谷胱甘肽氧 化还原系统，pH值在8. 0以上，其优选配方为0. lMTris-HCl， ImM GSH， 0. ImM GSSG。专利技术人发现采用此缓冲液体系可保证复性出来的人重组Chemerin蛋白在pH调整至7. 0 以下时仍然保持可溶形式，而在其它一些复性液体系下，复性之后的蛋白质在pH调整至 7.0以下时，人重组Chemerin蛋白不可逆的沉淀。在一实施方式中，所述人重组Chemerin蛋白的纯化步骤，包括 (1)阴离子交换柱纯化人重组Chemerin样品上阴离子交换柱，洗脱缓冲液A洗脱，收集蛋白洗脱液；其中，洗脱缓冲液A为Tris-HCl缓冲液，pH6.5-8.0，优选为20mM Tris-HCl， ImM EDTA,25mMNaCl，pH7.0。(2)阳离子交换柱纯化(1)所得的蛋白洗脱液调节pH至4.5，上阳离子交换柱，洗脱缓冲液B， 1.0ml/min洗脱， 收集电导〉60mS/cm的洗脱峰。其中，洗脱缓冲液B为醋酸盐缓冲液，pH3.0-5.0，优选50mMNaAc-HAc, lmMEDTA， pH4.5。本领域技术人员均了解，真核蛋白新生的多肽链大多数是没有功能的，必须加工修饰 才能转变为有活性的蛋白质，如磷酸化、糖基化等修饰并切除新生肽链非功能所需片段， 为有功能的蛋白质。原核表达系统工艺成熟、成本低廉，但原核表达系统缺少这些加工修 饰功能，常导致原核表达系统中合成的真核蛋白或因折叠方式不正确，或因折叠效率低下， 结果使得蛋白活性低或无活性。本专利技术首次公开了人重组chemerin蛋白、重组载体和转化体及其制备方法。本专利技术所 提供的人重组chemerin蛋白为直接具有活性的形式。本专利技术所述制备人重组chemerin蛋 白的方法，工艺简单、成本低廉，不需要酶切等额外的步骤，所生产的重组chemerin蛋 白产品纯度达到98%以上，内毒素含量低，活性高。这为chemerin蛋白在新药研发和检测 试剂的应用提供了丰富的、高质量的原料。附图说明图l.PCR电泳图。图2. pET28a重组质粒的示意图。图3.人重组Chemerin蛋白SDS-PAGE电泳图。图4.人重组Chemerin蛋白毛细管蛋白电泳图。图5.人重组Chemerin蛋白对于小鼠腹腔巨噬细胞的趋化作用。具体实施例方式下文将进一步详细讨论本专利技术的多个方面。通过从酵母、如细菌的微生物或人或动物细胞系中分泌，可产生重组分子形式的本发 明的人重组chemerin蛋白。任选从宿主细胞中分泌多肽。许多表达系统是已知的和可用的，包括细菌(例如大肠杆菌和枯草芽袍杆菌)，酵母(例 如酿酒酵母、乳克鲁维酵母和巴斯德毕赤酵母)，丝状真菌(例如曲霉)，植物细胞，动物细胞和昆虫细胞。本专利技术包括编码本专利技术的人重组chemerin蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、 转化体。本专利技术中，转化体(transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人重组ｃｈｅｍｅｒｉｎ蛋白，为如下（ａ）或（ｂ）的蛋白 （ａ）其氨基酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所述的蛋白； （ｂ）在（ａ）中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有淋巴细胞趋化作用活性的由（ａ）衍生的蛋 白。
【技术特征摘要】
1.一种人重组chemerin蛋白，为如下(a)或(b)的蛋白(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的蛋白；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有淋巴细胞趋化作用活性的由(a)衍生的蛋白。2. —种编码权利要求1所述的人重组chemerin蛋白的多核苷酸分子。3. —种包含权利要求2所述多核苷酸分子的重组表达载体。4. 一种包含权利要求3所述重组表达载体的转化体。5. —种权利要求l所述人重组chemerin蛋白的制备方法，包括如下步骤a) 人重组Chemerin蛋白表达载体的构建；b) 人重组Chemerin蛋白的表达；c) 人重组Chemerin蛋白的纯化。6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述人重组Chemerin蛋白表达载体为包 含编码权利要求1所述人重组chemerin蛋白DNA的表达载体。7. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述表达载体可为原核表达载体或真核 表达载体。8. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述表达载体可为pET28a质粒。9. 如权利要求10所述的制备方法，其特征在于所述人重组Chemerin蛋白转化体是包 含编码权利要求1所述的人重组chemerin蛋白表达载体的大肠杆菌。10. 如权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述人重组Chemerin蛋白表达载体为 包含编码SEQ IDNO.l所述人重组chemerin蛋白DNA的表达载体。11. 如权利要求9所述的制备方法，其特征在于在步骤c...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩伟，向砥，
申请(专利权)人：再生医药有限公司，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]
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