一种抗虫融合基因、编码蛋白、载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗虫融合基因、编码蛋白、载体及其应用，所述抗虫融合基因是将编码BT杀虫晶体蛋白Cry1Ab的核苷酸序列和编码BT营养期杀虫蛋白Vip3A的核苷酸序列用连接肽编码基因连接构成；所述连接肽氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示；本发明专利技术所述抗虫融合蛋白杀虫活性提高，杀虫谱更广。本发明专利技术的杀虫蛋白质可以杀灭粘虫、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾等水稻、玉米的主要鳞翅目害虫。此外，本发明专利技术所述抗虫融合蛋白还可以有效减缓害虫抗性的发生。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种抗虫融合基因及其应用。(二)
技术介绍
害虫给全球农业生产带来每年约80亿美元的损失，害虫的防治目前主要依靠使用化学农药，但是农药的残留会对人体健康和环境带来不良影响。利用生物技术方法培育含有抗虫基因的转基因抗虫农作物，可以大幅度降低化学杀虫剂的使用，有效保护农作物免受害虫为害，目前转基因抗虫玉米、棉花等已经大量推广种植。转基因作物抗虫的关键技术是获得性能优良的杀虫蛋白质，杀虫蛋白质有多种。比较常用的是BT杀虫晶体蛋白，如Cry1Ab、Cry1C等，它们已被大量运用于转基因抗虫作物；近年来在BT中发现的另一种营养期杀虫蛋白也被证明具有较好的抗虫活性，如Vip1A、Vip3A等。单个杀虫毒素往往杀虫谱比较窄，杀虫活性有限；同时，长期大量地使用单一的杀虫蛋白质，还可能引起害虫抗性的产生和发展。因此，获得高杀虫活性的新型蛋白质杀虫毒素，对提高杀虫能力和减缓害虫抗性的发生具有重要的应用价值。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种具有高杀虫能力的抗虫融合蛋白、编码基因及其应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种抗虫融合基因，所述抗虫融合基因是将编码BT杀虫晶体蛋白Cry1Ab的核苷酸序列(SEQIDNO:4所示)和编码BT营养期杀虫蛋白Vip3A的核苷酸序列(SEQIDNO:5所示)用连接肽编码基因从5’-3’依次连接构成；所述连接肽氨基酸序列为SEQIDNO:1所示，核苷酸序列为SEQIDNO:6所示。进一步，所述抗虫融合基因的核苷酸序列为SEQIDNO:2所示。本专利技术还提供一种所述抗虫融合基因编码蛋白，所述抗虫融合基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:3所示，融合蛋白从N端至C端依次为Cry1Ab蛋白、连接肽和Vip3A蛋白。本专利技术还涉及一种所述抗虫融合基因构建的重组载体。本专利技术提供一种所述抗虫融合基因在制备抗虫植物细胞中的应用，所述植物为单子叶植物，优选为水稻、玉米、小麦或高粱。本专利技术还提供一种所述抗虫融合基因在制备抗虫剂中的应用，所述抗虫剂为鳞翅目幼虫抗虫剂，包括粘虫、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫或甜菜夜蛾。本行业的技术人员均知道以下理论：1)两个抗虫基因的简单融合并不是都能够增强杀虫能力的。例如Cry1Ab和Cry1Ca的融合蛋白质的杀虫能力比相同重量的单独Cry1Ab和Cry1Ca的混合物的杀虫能力还要低。2)即使两个单独蛋白质组合使用具有增效作用，但也并不能得出它们的混合蛋白具有高效杀虫能力。这是因为：在蛋白质生物化学上，两个单独蛋白质的物理混合与融合是不同的，不能根据物理混合所具有的增效作用来肯定融合后所获得的增效作用；且在不同位置融合所得的融合蛋白的活性是大相径庭的。3)Vip3A基因单独转入植物可能对转基因植物产生一定毒性。在获得的高表达Vip3A蛋白的转基因作物中，该蛋白由于信号肽的分泌作用大量聚集并结合在植物细胞膜上并形成孔道，从而对植物细胞形成一定的损坏，影响植株生长发育，同时转基因植株的抗虫活性也不高。本专利技术所设计的以一段24个氨基酸为连接肽、将Cry1Ab蛋白和Vip3A蛋白融合成人工蛋白质分子。24个氨基酸的连接肽来自于单子叶植物玉米(Zeamays)，是玉米几丁质酶(Chitinase)中的一段短肽。几丁质是真菌细胞壁、昆虫外壳的重要组成部分。几丁质酶(Chitinase)是一种广泛存在于植物中的内源性蛋白质，具有抵御病原性真菌、食草昆虫等重要作用。几丁质酶可以将几丁质链随机切割，从而达到自我保护的作用(Shoresh,2008)。玉米几丁质酶是一段长度为283个氨基酸的蛋白质，它有两个功能域(domain)，分别是几丁质结合功能域(chitin-bindingdomain,CBD)以及几丁质酶催化功能域(catalyticdomainofchitinase)(Zshen,1998)。在这两段功能域之间有一段短肽，其本身并非相邻两个功能域的任何一部分、无活性结构，它将两段功能域连接起来，使这两个功能域能够有效地发挥活性。本专利技术中所使用的连接肽即该段短肽，它由玉米基因组中的几丁质酶基因编码而来，可以将两个独立的蛋白质有效连接成为一个融合蛋白质、同时该蛋白具有这两个蛋白质的功能。与Cry1Ab和Vip3A蛋白的物理混合相比，本专利技术方法具有如下优点：本专利技术所述抗虫融合蛋白杀虫活性提高，杀虫谱更广。本专利技术的杀虫蛋白质可以杀灭粘虫、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、甜菜夜蛾等水稻、玉米的主要鳞翅目害虫。此外，本专利技术所述抗虫融合蛋白还可以有效减缓害虫抗性的发生。(四)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：本专利技术以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的JohnWileyandSons公司出版的CurrentProtocolsinMolecularBiology，和J.Sambrook等编写的ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)出版的MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdED.等文献均有详细的说明。实施例1、Cry1Ab-Vip3A融合基因的构建由上海生工人工合成抗虫基因Cry1Ab核苷酸序列为SEQIDNO:4，Vip3A核苷酸序列为SEQIDNO:5和连接肽CL核苷酸序列为SEQIDNO:6。将抗虫基因Cry1Ab和Vip3分别克隆到表达载体pET28a(Novagen，69864-3，美国)中限制性内切酶BamHI和SacI的位点之间，得到的载体分别命名为pET-1Ab和pET-v3。Cry1Ab-Vip3A构建过程：Cry1Ab片段由BamHI和XmaI酶切pET-1Ab获得，Vip3A片段由XmaI和SacI酶切pET-v3获得。载体pET28a经过BamHI和SacI酶切以后，与Cry1Ab及Vip3A连接，得到载体pET-1Ab-v3。用XmaI单酶切载体pET-1Ab-v3，与CL连接，得到载体pET-1Ab-CL-v3。这个载体包含一个融合基因，Cry1Ab-Vip3A(如SEQIDNO:2)，其编码一个氨基酸序列为SEQIDNO:3的融合蛋白质。实施例2、杀虫蛋白质的制备将实施例1方法制备的包含抗虫基因的载体pET-1Ab、pET-v3、pET-1Ab-v3、pET-1Ab-CL-v3分别导入BL21(DE3)细胞系(Escherichiacoli)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗虫融合基因，其特征在于所述抗虫融合基因是将编码BT杀虫晶体蛋白Cry1Ab的核苷酸序列和编码BT营养期杀虫蛋白Vip3A的核苷酸序列用连接肽编码基因连接构成；所述连接肽氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种抗虫融合基因，其特征在于所述抗虫融合基因是将编码BT杀虫晶体蛋白
Cry1Ab的核苷酸序列和编码BT营养期杀虫蛋白Vip3A的核苷酸序列用连接肽编码基因
连接构成；所述连接肽氨基酸序列为SEQIDNO:1所示。
2.如权利要求1所述抗虫融合基因，其特征在于所述连接肽编码基因核苷酸序列为
SEQIDNO:6所示。
3.如权利要求1所述抗虫融合基因，其特征在于所述抗虫融合基因的核苷酸序列为
SEQIDNO:2所示。
4.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：许超，沈志成，张先文，林朝阳，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33