本发明专利技术公开了一种黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗虫性能方面的应用。所述黄瓜花叶病毒弱毒力载体的构建方法包括如下步骤：1)、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表达载体；具体为：将已构建好的病毒CMV侵染性克隆质粒之一pCB‑CMVF209采用酶切连接的方法改造，使2b基因缺失，并加入酶切位点，构建成为弱毒力的病毒表达载体‑‑‑弱病毒载体；2)、将抗虫基因编码区(ORF)序列插入步骤1)所得的弱病毒载体构建重组弱病毒表达载体；构建所得的含抗虫基因编码区序列的重组弱病毒表达载体用于增强植物对害虫的抗性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒载体的用途，特别是黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus，CMV)弱毒力载体在增强植物抗虫性能方面的应用。
技术介绍
现有研究开发的植物病毒载体可分为三种用途：一是主要用于表达药用蛋白、抗体等；二是用于分析或利用外源基因功能；三是用于病毒诱导的基因沉默分析被沉默基因的功能。在病毒载体用于外源蛋白表达的研究方面，早期研究开发病毒载体的目的主要用于外源蛋白表达。利用植物病毒载体表达外源基因的方法主要有两种：一是在体外转录携带目的基因的侵染性cDNA克隆，将病毒基因组cDNA进行基因取代、插入融合等[14]，外源基因被加入后，便置于原核启动子下游，然后以其转录物RNA直接侵染植物或者用基因枪的方法将病毒载体转入植物中完成侵染，接种植物后病毒在寄主细胞内自主增殖进行外源基因的表达[15]；二是将侵染性病毒的基因组cDNA克隆插入到Act2、CaMV35S转录启动子等下游构建携带目的基因的侵染性重组病毒体，采用农杆菌转化法浸润接种植物，从而在寄主细胞内完成一系列转录、合成及装配过程，实现外源基因的表达过程。Marillonnet等在前人的基础上建立了农杆菌浸润(Agro-infiltration)接种技术，便使得病毒载体用于外源蛋白表达达到了一个令人满意的水平，使外源蛋白的表达又踏上了一个新台阶[16]。至今用于表达药用蛋白的主要病毒载体及表达的药用蛋白或抗原如下[17-18]：豇豆花叶病毒(cowpea mosaic virus，CPMV)表达的口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原、人免疫缺陷病毒(HIV-1)gp41抗原、人鼻病毒(HRV-14)抗原、犬细小病毒(CPV)抗原、慢性肺炎病菌(Pseudom aeruginosa)外层腊蛋白F抗原、stahylococcus aureus D2domain肽、疟疾抗原、水貂肠炎病毒(MEV)抗原、对传染性肠胃炎病毒(TGEV)具有特异性小分子免疫蛋白(SIP)、乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)。TMV载体表达的有血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、流感病毒血凝素、人免疫缺损病毒(HIV-1)抗原、疟疾抗原、鼠带状疮疹ZP3糖蛋白、口蹄疫病毒(FMDV)VP1抗原、α-天花粉蛋白、38C13鼠B细胞淋巴瘤单链抗体、肠癌病毒单抗、口蹄疫病毒(FMDV)VP1、牛孢疹病毒I型(BHV-1)gDC、猪传染性腹泻病毒(PEDV)中和表位；TBSV表达的人免疫缺损病毒(HIV-1)V3环抗原、犬细小病毒(CPV)抗原；PVX载体表达的有人免疫缺损病毒(HIV-1)gp41抗原、轮状病毒VP6抗原、人类乳突病毒16(HPV-16)E7蛋白抗原、人乳铁蛋白N叶、人粒细胞 巨噬细胞集落剌激因子(GM-CSF)、肺结核抗原ESAT-6；ALMV载体表达的有呼吸道合胞病毒(RSV)G蛋白抗原；PPV病毒载体表达的兔出血热病毒(RHDV)VP60抗原；三叶草黄脉病毒Clover yellow vein virus(ClYVV)载体表达可溶性甲烷单加氧酶C亚单位(sMMO-C)；CMV载体表达的aFGF蛋白等。在病毒载体用于分析或利用外源基因功能方面，植物病毒载体除了用于表达疫苗抗原、抗体和药用蛋白生产外，还可用于表达外源基因，分析基因功能，分析外源蛋白与植物中蛋白质的相互作用。例如，含番茄叶霉病菌avr9无毒基因的PVX重组表达载体通过农杆菌浸润接种带有抗病(R)基因cf-9的番茄植株叶，番茄植株会发生过敏反应，表明R基因表达的产物可与avr9基因产物发生了直接的相互作用[18]。在病毒载体用于分析被沉默基因的功能方面，病毒介导的基因沉默(VIGS)是根据植物对RNA病毒独特的防御机制发展而来的一种技术，因其操作简便、效率高、周期短、避免植物转化、克服基因重复等特点，可以在不同的遗传背景下工作，对基因的分析更清楚，渐渐成为了研究植物基因功能的一种有效方法。在正向遗传学及反向遗传学发现和鉴定基因功能的研究方面发挥着重要的作用，越来越多的植物病毒被改造成有效的沉默载体，在植物生长发育、抗逆、信号转导等功能研究方面取得了显著的进展[20]。1997年，Van Kammen等[21]最早对VIGS进行了定义，最初的意义是用来描述植物收病毒侵染后产生的症状恢复现象。后来，VIGS专指利用重组病毒载体携带外源基因侵染植物后，随着病毒的复制和移动特异性的诱导植物沉默自身内源基因的一种现象[22,23]。1995年，Kumagai[24]等人，以烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)为载体进行改造，他在TMV中插入了一段从烟草cDNA反转录出来的(phytoene desaturase,PDS)序列,利用这个携带PDS序列的病毒载体侵染烟草后，植物出现系统性褪绿的光漂白现象，同时PDS的mRNA水平也出现显著性降低。结果说明植物出现漂白现象是由于PDS表达水平下降导致的，而PDS是类胡萝卜素合成过程中的关键酶，对植物有着光保护作用。1998年，Ruiz等[25]采用PVX马铃薯X病毒(Potato X virus)载体携带PDS的序列的方法，也引发植物出现了相同的光漂白现象。后来，人们利用改造的VIGS载体对植物进行目的性的基因沉默，抑制内源基因的表达，从而达到研究植物基因功能的作用。1998年，Kjemtrup等[26]利用双生病毒科的番茄金色花叶病毒(STMV)为VIGS载体插入镁离子螯合酶(magnesium chelatase)的关键基Su(Sulfur)和转荧光蛋白基因luc(luciferase),从而引起了植物出现叶片黄化和转luc植物不再发出荧光的表型。2001年，Ratcliff等[27]，报道了以烟草脆裂病毒TRV构建的VIGS载体，相比于PVX、TMV、TGMV有许多优点，其中TRV的VIGS载体相比于PVX对植物的症状影响较轻，并且在沉默效率、侵染范围、持久性方面都比PVX更加完善。2002年，Liu等[28]利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV) 在番茄中进行了VIGS试验，可以对已经公布的番茄EST文库进行功能研究分析。目前，TRV是应用范围最广的VIGS病毒载体，不仅其诱导植物的沉默效率高，而且更容易诱导分生组织的基因沉默，目前在烟草、番茄等茄科植物中均有大量的报道。TRV载体目前有3个版本，最初由Ratcliff等[27]构建的版本，Liu等[29]的pYL156、pYL279修改版本、以及Valentine等 [30]构建的TRV-2b版本。其中，Liu等[29]的pYL156和pYL279版本，为了使病毒大量的在植株内扩增，该病毒还加入了2个35S启动子，并且在C端还加入了核酶。而TRV-2b的版本病毒载体中含有TRV RNA2中的2b序列。目前,TRV的病毒载体已在番茄、烟草、棉花(Gossypium spp.)、牵牛花[31]、拟南芥和罂粟(opium poppy)[32]等多种植物上被应用。2002年，Holzberg等[33]利用大麦条纹花叶病毒BSMV携带PDS片段，成功引起了大麦的白化现象，抑制了大麦PDS基因的表达，这是首次利用VIGS载体在单子本文档来自技高网...
【技术保护点】
黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗虫性能方面的应用。
【技术特征摘要】
2015.04.22 CN 20151019413461.黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗虫性能方面的应用。2.根据权利要求1所述的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗虫性能方面的应用，其特征是：所述黄瓜花叶病毒弱毒力载体的构建方法包括如下步骤：1)、改造病毒CMV成缺失2b基因序列的弱病毒表达载体：将已构建好的病毒CMV侵染性克隆质粒之一pCB-CMVF209采用酶切连接的方法改造，使2b基因缺失，并加入酶切位点，构建成为弱毒力的病毒表达载体---弱病毒载体；2)、将抗虫基因编码区(ORF)序列插入步骤1)所得的弱病毒载体构建重组弱病毒表达载体；构建所得的含抗虫基因编码区序列的重组弱病毒表达载体用于增强植物对害虫的抗性。3.根据权利要求2所述的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗虫性能方面的应用，其特征是：所述步骤1)中的酶切位点为：Stu I、Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I、Sac II。4.根据权利要求2或3所述的黄瓜花叶病毒弱毒力载体在增强植物抗虫性能方面的应用，其特征是：所述步骤1)具体包括如下步骤：①、以CMV序列为模板，设计加酶切位点的正、反向引物:加酶切位点Nco I的正向引物NcoIF2:CATGCcatggctgagtttgcctg；加酶切位点Stu I的反向引物为以下任一：gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttgg；gaAGGCCTTCTAaattctttcgctgtttgttg；以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，以Nco I、Stu I酶切PCR产物，纯化；②、选择Stu I以及Mlu I、Spe I、Apa I、BamH I中至少1个酶切位点加入正向引物的5’，设计在5’加入Avr II酶切位点的反向引物；以质粒pCB-CMVF209为模板，PCR扩增合成PCR产物，以Stu...
【专利技术属性】
技术研发人员：竺锡武，吴娟，王强，刘津，李晓超，王青，陈亚妮，
申请(专利权)人：湖南人文科技学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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