本发明专利技术涉及了一种抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸、包括该多核苷酸的表达盒及其应用；包括第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸；所述第一多核苷酸包括EPSP合酶的编码区；所述第二多核苷酸包括营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区；所述第三多核苷酸包括杀虫蛋白Cry2A的编码区；可以在植物组织中编码EPSP合酶、营养期杀虫蛋白VIP3A和苏云金芽孢杆菌δ‑内毒素即杀虫蛋白Cry2A；还涉及第一表达盒、第二表达盒、第三表达盒和第四表达盒组成DNA构建体，利用DNA构建体转化植物的方法；通过增强协同表达使转基因植物比第一代单基因Bt植物对鳞翅目昆虫具有更强的抗性，且具有耐除草剂的特性，有利于农田除草的进行。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程
，更具体地，涉及一种抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸、包括该多核苷酸的表达盒及其应用。
技术介绍
棉花是纺织工业中重要的原料来源，并且占有1.4％的GDP和巴基斯坦农业产值的6.7％。在2013年7月至2014年3月期间，纺织工业获得103.85亿美元的外汇收入。在2013至2014年期间，棉花作物种植面积为2,806,000公顷，比2012至2013年的2,879,000公顷面积少2.5％。在2013至2014年期间，相对于1410万包的目标，棉花的产量停留在1280万包，显示出相对于目标值下降9.2％，以及与上一年度的1300万包产量相比，显示出2.0％的下降(巴基斯坦经济调查，2014年)。害虫是全世界产棉区中棉花作物的重大问题。在巴基斯坦，棉花作物主要受到许多种鳞翅昆虫幼虫的损害，如棉花翠纹金刚钻、美洲棉铃虫、棉红铃虫和粘虫等。这些幼虫以棉铃或花为食，因此引起直接的巨大产量损失。在2010至2012年，在三个集中的产棉省：旁遮普省、信德省和俾路支省，公共和私营部门机构已使16个Bt棉花品种的种子通过了旁遮普种子理事会(PSC)的临时批准。在16个批准的Bt棉花品种中(包括一个Bt棉花杂种)，有15种是含有Cry1Ac基因(MON531事件)的，而Bt棉花杂种GFM-2085表达融合基因Cry1Ac和Cry1Ab(James，2013年)。但由于许多原因，棉花生产在巴基斯坦仍然不景气。病毒和害虫对棉花的侵袭明显阻碍了棉花生产。虽然国家在86％的区域上采用了转基因棉花(单基因Bt)，这还是在2013至2014年期间收到了棉红铃虫和其他鳞翅目害虫的影响(Khuhro等人，2015年)的报道。近年来，在信德省，棉红铃虫已成为常规Bt棉花品种的真正威胁。棉红铃虫损害了20～30％的棉花作物的子实(Ahmed，2013年)。尽管Bt棉花品种Bollguard-II(B G-2)和抗农达Flex(RRF)棉在南部的旁遮普省和信德省市场可以得到，但令人意外的是，农民们报告了由于在GM品种棉花作物中低水平的Bt毒素，导致了棉田不断受到害虫的侵害(GM Watch，2014年)。根据以上情景，随着对Bt毒素产生抗药性的昆虫的数量增加，人们可以想象种植大田的惨淡前途。Bt毒素的更低表达水平，非但不能杀死鳞翅昆虫幼虫，反而有助于它们产生抗性。Bravo等人(2013年)也认为，在转基因植物中使用Cry毒素是导致昆虫出现抗性的原因。发生了演化而对大田中Bt作物产生了抗性的昆虫已有记载至少五种不同的昆虫物种(van Rensburg，2007年；Tabashnik等人，2008年；Bagla，2010年；Storer等人，2010年；Gassmann等人，2011年)。为了延缓昆虫对含有从苏云金芽孢杆菌产生的杀虫蛋白的转基因作物产生抗性，采用了“金字塔”策略，该策略利用了能够产生杀死同一种害虫的两种或更多种毒素的植物(Wei等人，2015年；Brevault等人，2013年)。用于控制昆虫的转基因作物的扩展包括：该作物品种具有两种或更多种Bt毒素，以及新的Bt毒素如营养期杀虫蛋白(VIP)组合(Tabashnik等人，2009年)。因此，在巴基斯坦，开发包括除了Cry1Ac以外的其他叠加的Bt基因的新GM植物的栽培技术成为核心，所述新栽培种显示出更高的杀虫毒素靶向表达。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于合成一种抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸，通过该多核苷酸，可以在植物组织中编码EPSP合酶、营养期杀虫蛋白VIP3A和杀虫蛋白Cry2A，进一步来说，该多核苷酸可以在绿色组织中靶向表达。实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸，包括：第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸；第一多核苷酸包括EPSP合酶的编码区；第二多核苷酸包括营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区；第三多核苷酸包括杀虫蛋白Cry2A的编码区。作为本专利技术的一种优选的方案：EPSP合酶的编码区的序列如S EQ ID No.1所示；营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区的序列如SEQ ID No.2所示；杀虫蛋白Cry2A的编码区的序列如SEQ ID No.3所示。作为本专利技术的一种优选的方案：第一多核苷酸还包括第一CTP的编码区；第二多核苷酸还包括第二CTP的编码区；第三多核苷酸还包括第三CTP的编码区。本专利技术的第二个目的在于提供一种编码EPSP合酶、营养期杀虫蛋白VIP3A和杀虫蛋白Cry2A的表达盒，该表达盒通过增强协同表达使转基因植物比第一代单基因Bt植物对鳞翅目昆虫具有更强的抗性，且具有耐除草剂的特性，有利于农田除草的进行。实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：表达盒包括第一表达盒、第二表达盒、第三表达盒和第四表达盒。作为本专利技术的一种优选的方案，第一表达盒包括上述的第一多核苷酸、第一启动子和第一终止子。优选地，第一启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子。优选地，第一表达盒还包括第一5’非编码区；第一5’非编码区侧接在第一CTP的编码区与第一启动子之间。再优选地，第一5’非编码区包括第一内含子。再优选地，第一内含子来自陆地棉SCFP基因、油菜叶绿素a/b结合蛋白基因或矮牵牛叶绿素a/b结合蛋白基因的其中之一。作为本专利技术的一种优选的方案，第二表达盒包括上述的第二多核苷酸、第二启动子和第二终止子。优选地，第二启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子或裂叶牵牛亮氨酸拉链启动子。优选地，第二表达盒还包括第二5’非编码区；第二5’非编码区侧接在第二CTP的编码区与第二启动子之间。再优选地，第二5’非编码区包括第二内含子。再优选地，第二内含子来自陆地棉SCFP基因、油菜叶绿素a/b结合蛋白基因或矮牵牛叶绿素a/b结合蛋白基因的其中之一。作为本专利技术的一种优选的方案，第三表达盒包括上述的第三多核苷酸、第三启动子和第三终止子。优选地，第三启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子、裂叶牵牛亮氨酸拉链启动子或GhSCFP启动子的其中之一。优选地，第三表达盒还包括第三5’非编码区；第三5’非编码区侧接在第三CTP的编码区与第三启动子之间。再优选地，第三5’非编码区包括第三内含子。再优选地，第三内含子来自陆地棉SCFP基因、油菜叶绿素a/b结合蛋白基因、矮牵牛叶绿素a/b结合蛋白基因或裂叶牵牛亮氨酸拉链基因的其中之一。作为本专利技术的一种优选的方案，第四表达盒包括第四启动子、标记基因和第四终止子。优选地，标记基因为潮霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因。本专利技术的第三个目的在于提供一种通过将多核苷酸构建表达盒并用于植物的蛋白表达上，具体地说，给出了苏云金芽孢杆菌δ-内毒素即杀虫蛋白Cry2A、营养期杀虫蛋白VIP3A和EPSP合酶的显著增强表达方法。实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸的应用，将多核苷酸构建表达盒并用于植物的蛋白表达上。作为本专利技术的一种优选的方案，植物的蛋白表达为靶向叶绿体的蛋白表达。优选地，植物的蛋白表达步骤包括：1)利用上述的第一多核苷酸构建第一表达盒；利用上述的第二多核苷酸构建第二表达盒；利用上述的第三多核苷酸构建第三表达盒；构建上述的第四表达盒；2)用步骤1)获得的第一表达盒、第二表达盒本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸，其特征在于包括：第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸；所述第一多核苷酸包括EPSP合酶的编码区；所述第二多核苷酸包括营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区；所述第三多核苷酸包括杀虫蛋白Cry2A的编码区。
【技术特征摘要】
2016.02.15 PK 96-20161.一种抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸，其特征在于包括：第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸；所述第一多核苷酸包括EPSP合酶的编码区；所述第二多核苷酸包括营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区；所述第三多核苷酸包括杀虫蛋白Cry2A的编码区。2.如权利要求1所述的抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸，其特征在于：所述EPSP合酶的编码区的序列如SEQ ID No.1所示；所述营养期杀虫蛋白VIP3A的编码区的序列如SEQ ID No.2所示；所述杀虫蛋白Cry2A的编码区的序列如SEQ ID No.3所示。3.如权利要求1所述的抗除草剂的抗虫植物的多核苷酸，其特征在于：所述第一多核苷酸还包括第一CTP的编码区；所述第二多核苷酸还包括第二CTP的编码区；所述第三多核苷酸还包括第三CTP的编码区。4.一种抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于：所述表达盒包括第一表达盒、第二表达盒、第三表达盒和第四表达盒。5.如权利要求4所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于：所述第一表达盒包括如权利要求3所述的第一多核苷酸、第一启动子和第一终止子。6.如权利要求5所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于：所述第一启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子。7.如权利要求5所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于：所述第一表达盒还包括第一5’非编码区；所述第一5’非编码区侧接在第一CTP的编码区与第一启动子之间。8.如权利要求7所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于：所述第一5’非编码区包括第一内含子。9.如权利要求8所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于：所述第一内含子来自陆地棉SCFP基因、油菜叶绿素a/b结合蛋白基因或矮牵牛叶绿素a/b结合蛋白基因的其中之一。10.如权利要求4所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于：所述第二表达盒包括如权利要求3所述的第二多核苷酸、第二启动子和第二终止子。11.如权利要求10所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于：所述第二启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子或裂叶牵牛亮氨酸拉链启动子。12.如权利要求10所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于：所述第二表达盒还包括第二5’非编码区；所述第二5’非编码区侧接在第二CTP的编码区与第二启动子之间。13.如权利要求12所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于：所述第二5’非编码区包括第二内含子。14.如权利要求13所述的抗除草剂的抗虫植物的表达盒，其特征在于：所述第二内含子来自陆地棉SCFP基因、油菜叶绿素a/b结合蛋白基因或矮牵牛叶绿素a/b结合蛋白基因的其中...
【专利技术属性】
技术研发人员：达尼亚·贾德·库雷西·索·贾德·萨利姆·库雷西，哈姆萨·纳迪姆·库雷西·索·穆罕默德·纳迪姆·库雷西，
申请(专利权)人：达尼亚·贾德·库雷西·索·贾德·萨利姆·库雷西，哈姆萨·纳迪姆·库雷西·索·穆罕默德·纳迪姆·库雷西，
类型：发明
国别省市：巴基斯坦;PK
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