本发明专利技术提供了一种松江鲈肌酸激酶TfM‑CK基因、松江鲈TfM‑CK重组蛋白及其应用，属于基因工程技术领域，不仅获得了松江鲈肌酸激酶TfM‑CK基因的cDNA全长序列，还通过原核表达获得了松江鲈TfM‑CK重组蛋白。本发明专利技术提供了一种松江鲈肌酸激酶TfM‑CK基因，其序列全长为1474bp，包含1146bp基因开放阅读框。本发明专利技术可用于作为鱼饲料免疫添加剂来增强鱼类病抗病力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种松江鲈肌酸激酶TfM-CK基因的cDNA全长序列，由其通过原核表达系统表达得到的松江鲈TfM-CK重组蛋白及其应用。
技术介绍
松江鲈(Trachidermus fasciatus)又名四鳃鲈，隶属于鲉形目(Scorpaeniforme)，杜父鱼科(Cottidae)，松江鲈属(Trachidermus)，是一种典型的降海洄游性的小型鱼类，整个生长期面临海水与淡水两种更加复杂的生存环境，曾广泛分布于我国沿海。近年来，由于水体污染及兴建河道水利等原因破坏了松江鲈栖息、繁殖和洄游路线，导致该物种种群数量锐减，分布区也急剧缩小，因此，研究、发展松江鲈的养殖和应用，具有重要的意义。肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)属于高度保守的磷酸原激酶家族，能够催化磷酸肌酸中的磷酸和ADP结合生成ATP的可逆反应。它广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物。在脊椎动物体内，CK是唯一的磷酸原激酶，通常存在于能量代谢旺盛的组织和细胞，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。临床上，人血清肌酸激酶是诊断组织病变的重要指标。尽管没有人提出CK是哺乳动物的急性期蛋白，但一些报道显示其可能和哺乳动物的急性期反应(acute phage reponse APR)相关。几乎所有动物受到创伤和感染等外界伤害时都会启动APR，合成APP(acute phage protein,APP)进行快速自我保护，抵御微生物的入侵，促进创伤的修复等，APR归于动物的先天免疫系统。CK有四种同功酶形式，即脑型、肌型、杂化型和线粒体型。目前，CK的研究大都集中在哺乳动物方面，尤其是人的肌型CK研究最多，且其在临床上有很高的应用价值。已有研究表明，脑型CK和肌肉型CK两种类型在鱼类中均有分布，例如鲤鱼(Cyprinus carpio)中存在肌肉型CK，而虹鳟(Oncorhynchus mykiss)中存在脑型CK。就肌型CK而言，在电鳗(Electrophorus electricus)、斑马鱼(Danio rerio)和鳜(Siniperca chuatsi)等中仅发现了一种肌型CK，然而在斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、北极黑鳍冰鱼(Chaenocephalus aceratus)等中则发现有2种不同的肌型CK，甚至在鲤中获得了3种不同的肌型CK。尽管鱼类中有发现不同类型CK基因，但是其功能研究基本处于尚未开展的阶段。最近高媛媛安艳、范宁宁研究等通过对文昌鱼(Branchiostoma belcheri Gray)的研究发现，文昌鱼CK是一种应激反应蛋白，具有凝集素活性。在前期的工作中，我们从松江鲈皮肤粘液刺激后明显上调表达的蛋白质谱分析中得到肌酸激酶CK的信息，故将其选为免疫蛋白进行进一步的研究。作为一种洄游性小型鱼类，复杂的生存环境导致其广泛的适应性及抵抗力，因此以松江鲈为研究对象，克隆获得CK基因全长序列以开展鱼类肌酸激酶在免疫方面的功能研究，并由此获得一种可作为鱼饲料免疫添加剂或免疫激活剂的鱼源重组蛋白，这对于本领域而言将具有深远意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种松江鲈肌酸激酶TfM-CK基因，由其通过原核表达系统表达得到的松江鲈TfM-CK重组蛋白及其应用，不仅获得了松江鲈肌酸激酶TfM-CK基因的cDNA全长序列，还通过原核表达获得了松江鲈TfM-CK重组蛋白，以应用于鱼饲料免疫添加剂方面来增强鱼类病抗病力。本专利技术的一方面提供了一种松江鲈肌酸激酶TfM-CK基因，其序列全长为1474bp，包含1146bp基因开放阅读框，其核苷酸序列如下：其中，序列中下划线标示的ATG为起始密码子，下划线标示的TAA为终止密码子，下划线示出的AATAAA为加尾信号。本专利技术的另一方面提供了一种利用所述松江鲈肌酸激酶TfM-CK基因编码的蛋白，包括381个氨基酸，其氨基酸序列如下：其中，N端结构域是从第24位氨基酸残基到第99位氨基酸残基，C端结构域是从第120为氨基酸残基到第367位氨基酸残基。本专利技术的再一方面提供了一种松江鲈TfM-CK重组蛋白，由上述技术方案所述的松江鲈肌酸激酶TfM-CK基因通过原核表达系统表达得到。在该技术方案中，所采用的原核表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，表达载体为pet30a。本专利技术的又一方面提供了一种由上述技术方案所述的松江鲈TfM-CK基因在制备鱼饲料添加剂中的应用。本专利技术的又一方面提供了一种由上述技术方案所述的松江鲈TfM-CK基因在制备治疗或预防水产养殖病害药物中的应用。本专利技术的又一方面提供了一种由上述技术方案所述的松江鲈TfM-CK重组蛋白在制备鱼饲料添加剂中的应用。本专利技术的又一方面提供了一种由上述技术方案所述的松江鲈TfM-CK重组蛋白在制备治疗或预防水产养殖病害药物中的应用。本专利技术通过松江鲈肌酸激酶TfM-CK基因的cDNA全长序列的获得，填补了松江鲈TfM-CK基因研究的空缺。同时，根据松江鲈TfM-CK基因序列可以人工合成或转基因生物合成具有生物活性的重组蛋白，有助于我们了解松江鲈TfM-CK基因的基因组结构，分析该基因的表达和蛋白的功能。此外，专利技术人通过松江鲈TfM-CK基因序列还构建得到了松江鲈TfM-CK基因重组蛋白，可作为鱼饲料中的免疫添加剂有效运用到水产养殖中。附图说明图1为本专利技术实施例2所提供的鳗弧菌刺激后TfM-CK基因在各组织中的表达模式变化图，其中，误差线是通过三次独立实验进行统计分析所得的标准差；图2为本专利技术实施例5所提供的松江鲈肌酸激酶TfM-CK重组蛋白糖结合定量表，其中，试验所得数值为3次重复试验平均值；图3为本专利技术实施例6所提供的TfM-CK重组蛋白对有凝集作用的金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和鳗弧菌(革兰氏阴性菌)以及没有凝集作用的绿脓杆菌的凝集示意图；图4为本专利技术实施例7所提供的TfM-CK重组蛋白对糖的抑制凝集对比图；图5为本专利技术实施例8所提供的分别注射鳗弧菌、鳗弧菌+松江鲈肌酸激酶TfM-CK重组蛋白后的鲤鱼死亡率示意图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1：松江鲈肌酸激酶TfM-CK基因的cDNA全长序列的获得：将鳗弧菌(V.anguillarum)刺激后的松江鲈皮肤粘液(实验组)与正常状态下的松江鲈皮肤粘液(对照组)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，通过对比两组蛋白的不同，将实验组相对于对照组上调表达的蛋白条带进行质谱分析，结果显示松江鲈M型肌酸激酶中含有FEEILTR、QKRGTGGVDT、ASVGGVFDIS肽段，根据已知的蛋白序列所对应的核苷酸序列以及NCBI网站上下载的其他物种：斑头鱼(Hexagrammos agrammus,AY583132.1)、十线六线鱼(Hexagrammos decagrammus,AY583138.1)、长线六线鱼(Hexagrammos lagocephalus,AY583136.1)、大泷六线本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种松江鲈肌酸激酶TfM‑CK基因，其特征在于，其序列全长为1474bp，包含1146bp基因开放阅读框，其核苷酸序列如下：其中，序列中下划线标示的ATG为起始密码子，下划线标示的TAA为终止密码子，下划线示出的AATAAA为加尾信号。
【技术特征摘要】
1.一种松江鲈肌酸激酶TfM-CK基因，其特征在于，其序列全长为1474bp，包含1146bp基因开放阅读框，其核苷酸序列如下：其中，序列中下划线标示的ATG为起始密码子，下划线标示的TAA为终止密码子，下划线示出的AATAAA为加尾信号。2.一种利用如权利要求1所述的松江鲈肌酸激酶TfM-CK基因编码的蛋白，其特征在于，包括381个氨基酸，其氨基酸序列如下：其中，N端结构域是从第24位氨基酸残基到第99位氨基酸残基，C端结构域是从第120为氨基酸残基到第367位氨基酸残基。3.一种松江鲈TfM-CK重组蛋白，其特征在于，由权利要求1所述的松...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘莹莹，祝茜，陈学昭，于珊珊，宋翠，蒋东方，王琛琪，
申请(专利权)人：山东大学威海，
类型：发明
国别省市：山东;37
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