TrkA基因作为绵羊产羔数性状的分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术属于绵羊分子标记筛选与应用技术领域，具体涉及TrkA基因作为绵羊产羔数性状的分子标记及其应用。本发明专利技术的分子标记克隆自TrkA基因(Gene Bank ID:101109763)。该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，在SEQ ID NO.1所示序列的432位碱基处存在一个C>T的碱基替换突变，该突变导致SacⅡ‑RFLP酶切多态性。在湖羊和小尾寒羊进行相关的关联分析应用。本发明专利技术为绵羊产羔数性状的标记辅助选择提供了一个新的遗传标记资源。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于绵羊分子标记筛选
，具体涉及TrkA基因作为绵羊产羔性状的分子标记及其应用。本专利技术的分子标记克隆自绵羊TrkA基因。
技术介绍
传统育种方法中，对家畜性状选择的方法多依赖于家畜的表型，这种方法在大家畜选育中需要丰富的经验和长达几十年时间。对于一些由微效多基因控制的低遗传力的数量性状，例如绵羊产羔性状，不仅由母羊自身遗传因素决定，且受到不同环境和饲养条件的影响，常规育种方法遗传改良进展缓慢。形态学标记、细胞学标记、生物化学标记以及免疫学标记虽然已经在优良种畜选育中进行应用，但由于这些标记的多态性低和信息量小，且是对基因的间接反映，受到基因与环境互作的影响比较大，在生产实践中有很大的局限性。随着分子生物学技术的发展，尤其是分子遗传标记技术的发展和完善，利用与目标性状紧密连锁的分子遗传标记，对目标性状进行跟踪性选择，减少育种过程中选择的盲目性，并可以进行早期选育，极大提高育种效率。TrkA(Tyrosine Kinase A)是由原癌基因trk编码的酪氨酸蛋白激酶受体，神经生长因子(NGF)以二聚体的形式与其相结合，诱导TrkA酪氨酸残基处磷酸化，通过激活磷脂酶Cγ(PLCγ)→磷脂酶肌醇激酶(PI3K)→衔接蛋白(Shc)信号通路将胞外信号传递到细胞核(马永和，2010)。TrkA不仅介导NGF对神经系统中胆碱能神经元的分化和发育的调控(Counts S等，2005)，而且在生殖系统也发挥功能，已经发现在人、鼠、金仓鼠、绵羊和山羊等动物卵泡均有TrkA基因表达(马永和等，2010)。不同发育阶段卵泡中TrkA表达丰度不同，猪的原始卵泡和初级卵泡的卵泡细胞和卵母细胞不表达TrkA，但在二级卵泡和三级卵泡的卵泡细胞及卵母细胞中有大量表达(Levanti MB等，2005)。NGF与TrkA参与早期卵泡的装配、颗粒细胞的增殖、卵母细胞的成熟及排卵等过程(Dissen GA等，2001)。在体外，NGF还可以促进牛腔前卵泡的发育(李海等，2005)和猪卵母细胞成熟(陆晨等，2013)。NGF-TrkA复合物对输卵管和子宫发育亦发挥重要作用，TrkA在子宫内膜细胞、腺细胞、基质细胞、输卵管黏膜上皮细胞均有表达，且卵泡期，输卵管中表达量显著高于卵巢(马永和等，2010)。现有文献表明，TrkA基因参与了动物繁殖调控过程，尤其是卵子发生和卵泡发育。因此，寻找该基因中变异位点，通过与产羔性状间的关联分析，是进行分子遗传标记辅助选择的基础。此专利技术开展了绵羊TrkA基因部分基因组序列克隆和SNP筛查、检测及与产羔数性状关联
分析，以提高繁殖力母羊选择的准确性，可望绵羊加快育种进程。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，特别是现有绵羊育种周期长、选择准确性低、无法进行早期选育等技术缺陷，提供一种提高绵羊产羔数性状关联的分子标记作为辅助选择的手段。本专利技术的核心在于通过PCR-RFLP技术对候选个体的TrkA基因部分序列进行基因型分析，为绵羊产羔数性状检测提供一种辅助选择的遗传标记。本专利技术的技术方案如下所述：申请人筛选得到一种绵羊产羔性状的分子标记，其核苷酸序列如下所述：CTCCCGACTCTCACCGCCACCCCCTCCGGCCCACAGTCCCGGCCAGCGTGCATCTGCAGCCCGCCGTGGAGCAGCACCACTGGTGCATCCCCTTCTCGGTGGACGGGCAGCCGGCGCCCTCTCTGCGCTGGCTCTTCAATGGCTCCGCGCTCAACGAGACCAGCTTCATCTTCACCGAGTTCCTGGAGCTGGCGGCCAACGAGACGGTGCGCCACGGCTGCCTGCGCCTCAACCAGCCCACCCACGTCAACAACGGCAACTACACGCTGCTGGCGACCAACCCGCTGGGCCGGGCCGCCGCTTGGGTCATGGCTGCCTTCATGGACAACCCTTTCGAATTCAACCCTGAGGACCCCATTCCTGGTGTGAGGGCCACCCTGAACCCTGCTCCCGCTCCCTGGGCCCCAGCCGGGTGCAGATCCAGGTATCCGY(C/T)GGAGGCCTGGCCCACTTCCCACTGAGATCCTGACCCTGGAACCTGGAGGGCCTGGTCCCAGATGGAAAGTAGCCTGGAGTTCTGGTGTCCAGCTCTGTGCTGGCTTCCTCG，在该序列的432碱基位处的Y是C或T，该突变导致RFLP-SacⅡ多态性。申请人得到一种扩增TrkA基因片段或检测所述分子标记SNP的引物对，该引物对的DNA序列如下所示：正向引物F：CTCCCGACTCTCACCGCC，反向引物R：CGAGGAAGCCAGCACAGA。申请人提供了一种筛选绵羊产羔性状分子标记的方法，所述的方法包括以下步骤：从绵羊外周血液全血中提取基因组DNA，在位于Gene Bank登陆号ID:101109763所述的绵羊TrkA基因序列的突变位点附近设计一对引物，该引物对的DNA序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，对绵羊基因组DNA进行PCR扩增和序列测定，得到如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，通过序列比对，筛查SNP，再利用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物对进行PCR扩增，将扩增获得片段利用限制性内切酶SacⅡ进行酶切分型及检测。本专利技术的具体步骤如下：采集湖羊和小尾寒羊外周血液，提取基因组DNA；设计了一种扩增上述TrkA基因(Gene Bank ID:101109763)片段和用于检测该基因片段的分子标记的引物对，该引物对DNA序列如下所示：正向引物F：CTCCCGACTCTCACCGCC，反向引物R：CGAGGAAGCCAGCACAGA。申请人应用上述所得的引物对克隆得到绵羊(品种为湖羊和小尾寒羊)TrkA基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，在该序列的432位碱基处发生一个等位基因突变，即碱基C与碱基T替换，该突变导致PCR-SacⅡ-RFLP多态性。更为详细的专利技术方案见《具体实施方式》所述。本专利技术筛选的分子标记可在绵羊产羔性状辅助选择中应用。附图说明序列表SEQ ID NO：1是绵羊产羔性状相关的分子标记的核苷酸序列(也是扩增TrkA基因寻找SNP突变位点的部分核苷酸序列)，序列长度为543bp，在该序列的第432位碱基处存在一个等位基因突变(C>T)。序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3是扩增SEQ ID NO：1所示序列引物对的DNA序列，也是实现绵羊C>T突变的PCR-ScaⅡ-RFLP基因型分型方法的引物对的序列。图1：是绵羊TrkA基因(如SEQ ID NO：1所述的序列)部分测序结果和SNP位点。图2：是绵羊TrkA基因(如SEQ ID NO：1所述的序列)PCR-ScaⅡ-RFLP检测结果。琼脂糖浓度为1％。附图标记说明：泳道M为DL2000DNA Marker(包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp共6种带型)，其中：TT基因型片段大小为543bp，CC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种绵羊产羔性状的分子标记，其核苷酸序列如下所述：上述序列的432碱基位处的Y是C或T，该突变导致RFLP‑SacⅡ多态性。

【技术特征摘要】
1.一种绵羊产羔性状的分子标记，其核苷酸序列如下所述：上述序列的432碱基位处的Y是C或T，该突变导致RFLP-SacⅡ多态性。2.扩增TrkA基因片段和检测权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，所述的引物对的序列如下所示：正向引物F：CTCCCGACTCTCACCGCC，反向引物R：CGAGGAAGCCAGCACAGA。3.一种筛选绵羊产羔性状分子标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：从绵羊外周血液全血中提取基因组DNA，在位于Gene Bank登陆...

【专利技术属性】
技术研发人员：李万宏，翁秀秀，乐祥鹏，张军霞，王维民，李发弟，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62