本发明专利技术公开了万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因及应用。其中万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因(TePDS1)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。在色素万寿菊花瓣组织中克隆获得了TePDS1基因，叶黄素含量测定和实时定量分析结果表明TePDS1基因在万寿菊花中表达量较高，其表达水平与叶黄素含量相关。本发明专利技术万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因在叶黄素等类胡萝卜素色素合成积累方面发挥作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种从色素万寿菊中克隆类胡萝卜素合成途径八氢番茄红素脱饱和酶基因TePDS1及其应用。
技术介绍
万寿菊(Tagetes erecta L.)是菊科万寿菊属1年生草本植物，原产美洲墨西哥等地，因其花花形大、绚丽多彩、植株适应性强、生产周期短，目前已在世界各地广泛引种，在我国也成为一种新兴的具有重要经济价值的植物资源。由于同等条件下比种植玉米或大豆增收1～2倍，万寿菊种植面积逐年增长，现我国已成为世界万寿菊叶黄素主产地。万寿菊花瓣呈现黄橙色主要是由于含有叶黄素，叶黄素在万寿菊中主要以脂的形式存在，可占花瓣色素含量的90％(汪殿蓓等，北方园艺，2007；Harikumar等，International Journal of Toxicology，2008)。人体不能合成叶黄素但可以利用食物中摄取的叶黄素酯，使其在体内转化成为游离叶黄素。由于叶黄素在人体不能合成，并有多种异构体，也难采用化学方法体外合成，因而最佳获取方法是从天然植物中提取。早在1985年经研究确定叶黄素是视网膜黄斑色素的组成成分后，国内外研究人员对叶黄素开展了深入研究，发现尽管叶黄素在多种水果和蔬菜中普遍存在，但其含量却极其微少，因而富含这一成分的万寿菊成为提取天然叶黄素的重要植物资源。叶黄素色泽鲜艳，高含量的叶黄素不仅可用作天然着色色素，还具有丰富的营养价值及药用价值，在医药、食品、禽类养殖、化妆品中广泛应用。用于药片糖衣、胶囊的着色、保健饮料着色，
或将高纯度的叶黄素酯制成硬胶囊、软胶囊、片剂、口服液等(周曦等，国外医学医学地理分册，2011)。叶黄素因其价格与黄金相当而有“软黄金”之称。做为有重要营养、药用价值的天然色素，国内外对叶黄素需求量正逐年增加，我国虽然是色素万寿菊主产地，但由于相应研究和产业化尚处于起步阶段，除少量自用外，国产浸膏绝大部分出口国外。而国内所需90％以上依靠进口，每年需花费大量外汇进口叶黄素制品，满足制药工业原料、食品添加剂以及饲料添加剂等需求(李娜等，北方园艺，2010；王旭梅，新疆农垦经济，2012；翟建英等，中国中医药信息杂志，2014)。我国在基础研究方面，李浦等(西北农业学报，2012)对万寿菊W217×W203组合的P1、P2、F1、B1、B2和F2共6个世代的叶黄素含量进行遗传分析，表明叶黄素含量性状以主基因遗传效应为主，多基因效应为辅。叶黄素是类胡萝卜素中的含氧多萜类物质。在植物体内，合成前体异戊烯基焦磷酸经多次缩合生成第一个类胡萝卜素-八氢番茄红素，再经脱氢、环化、羟基化、环氧化等转变为其它类胡萝卜素，整个过程由多种酶催化完成。通过拟南芥、番茄等模式植物的研究已经对这些类胡萝卜素生物合成途径基因有了比较多的了解，发现八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase，PSY)、八氢番茄红素脱饱和酶(phytoene desaturase，PDS)、番茄红素环化酶(lycopene cyclase，LYC)、胡萝卜素脱饱和酶(carotene desaturase，ZDS)、紫黄质脱环氧化酶(violaxanthin de-epoxidase，VDE)等在叶黄素等类胡萝卜素合成积累中发挥重要作用(Shengxiong Huang等，Nature communication，2013)。但作为叶黄素重要植物来源的万寿菊，其叶黄素合成途径的一些重要基因尚未克隆分离。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可用于类胡萝卜素类植物天然色素合成的基因——万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因Tagetes erecta phytoene desa turase 1(TePDS1)。本专利技术要解决的另外一个技术问题是提供一种万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因的编码蛋白。本专利技术要解决的还有一个技术问题是提供一种万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因在叶黄素等类胡萝卜素色素合成中的应用。对于万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因Tagetes erecta phytoene desa turase 1(TePDS1)，本专利技术采用的技术方案是，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。对于万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因的编码蛋白，本专利技术采用的技术方案是，编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。另外，万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因在包括叶黄素在内的类胡萝卜素合成中的应用。本专利技术的万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因的克隆方法如下：根据专利技术人对色素万寿菊的高通量转录组深度测序对TePDS1基因进行数据组装。然后利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计2对巢式PCR特异引物，从万寿菊花瓣中提取总RNA，反转录PCR(RT-PCR)克隆到TePDS1基因。本专利技术通过万寿菊叶、不同发育时期花组织的实时定量分析和叶黄素含量测量结果，表明本专利技术所述SEQ ID NO：1基因在类胡萝卜素色素合成方面具有作用。本专利技术的有益效果是：为在植物中提高叶黄素等类胡萝卜素色素含量提供了一种新的基因资源。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例的色素万寿菊栽培品种菊王的叶、花蕾、成熟花中TePDS1基因定量表达分析、叶黄素含量测定结果。具体实施方式下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook Russell的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1：万寿菊不同组织转录组测序1、试剂植物RNA提取试剂盒V1.2(DNase I)购于成都百菲特科技有限公司，RNA Library Prep Kit购于北京百迈客生物科技有限公司，其余试剂均为进口分装或国产分析纯产品。2、植物材料色素万寿菊(Tagetes erecta L.)栽培品种菊王由赤峰鑫卉园艺公司繁育提供。3、方法3.1 RNA提取按照植物RNA提取试剂盒V1.2所述操作步骤进行RNA提取。1)使用液氮研磨法破碎100mg植物组织，移至1.5mL离心管中，加入1ml溶液A；2)离心管中加入300μL溶液B和200μL氯仿，振荡30s混匀；3)室温13000rpm离心15min，RNA位于上清液，下侧有机相含有叶绿素等杂质；4)将上清700μL移至另1.5mL离心管中，下层有机相和中间层还有蛋白质和其他杂质，避免触及吸取；5)在上清液中加入0.5mL溶液C和0.2mL氯仿，上下颠倒振荡30s混匀；6)室温13000rpm离心6min；7)将上清转移至另一1.5mL离心管中，避免触及有机相；8)在上清中加入0.5倍体积溶液D，放置2min，上下颠倒振荡30s混匀；9)将混合物(每次最多900μL)加入离心吸附柱中，室温12000rpm离心1min，弃穿透液，清洗一次；10)加入700μL漂洗液，12000rpm离心1min，弃去穿透液；11)12000rpm离心2min；12)将5-6μL的Recombinant DNase I加入到45-44μL DNase I Buffer中吹打混匀配制成DNa本文档来自技高网...
【技术保护点】
万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
1.万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。2.如权利要求1所述万寿菊八氢番茄红素脱饱和酶基因的编码蛋白，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：牛向丽，刘莹，黄胜雄，田丽，刘永胜，刘国庆，周宇，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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