异戊二烯合成酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种异戊二烯合成酶基因及其应用，其解决了利用工程菌合成异戊二烯效率不高的技术问题，本发明专利技术提供了一种异戊二烯合成酶基因、其表达的蛋白质、含有异戊二烯合成酶基因的原核表达载体及工程菌以及产异戊二烯工程菌的制备方法及应用。本发明专利技术可广泛用于异戊二烯制备领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种异戊二烯合成酶基因及其应用。
技术介绍
自然界中,异戊二烯主要是由某些植物叶片排放至大气中的，而工业生产中，目前异戊二烯主要是由石油裂解物C5馏分萃取蒸馏而来。然而随着石油资源日益枯竭及不可再生，天然植物释放的异戊二烯收集又事倍功半，通过微生物工程菌生产异戊二烯成为一种可持续发展的必然趋势。据报道，每年植物释放到大气中的异戊二烯达到5百万吨，细菌自身又不具有异戊二烯合成酶基因，因此植物是异戊二烯合成酶(ISPS)很好来源。利用基因工程技术开展异戊二烯合成酶基因研究已取得了一些进展，研究人员分离鉴定得到了少量的异戊二烯合成酶基因，但国内尚未有这方面的报道。2000年，Miller B首次在杨树(白杨×颤杨)中获得了全长IspS基因，并且在大肠杆菌中得到了7.7nmol/mgDCW的异戊二烯(Miller B et al.Planta.2001213(3):483-7)；2005年,Sasaki克隆得到了白杨的IspS基因(Sasaki K et al.FEBS Lett.2005579(11):2514-8)；Thomas D.Sharkey于2005年克隆得到蒙大拿葛IspS cDNA全长(Sharkey TD et al.Plant Physiol.2005137(2):700-12.)，随后又扩充了数个杨柳科IspS基因，并且得到了刺槐的IspS cDNA全长序列(Sharkey TD et al,Evolution 201367(4):1026-1040)。可见国内外目前获得的异戊二烯合成酶大多限于杨柳科和豆科植物，豆科植物关于异戊二烯合成酶基因的研究主要集中在葛根、刺槐上,杨柳科的相关研究主要集中在杨属，而在壳斗科夏橡中并无研究报道，
基因库中也没有夏橡异戊二烯合成酶基因。
技术实现思路
本专利技术就是为了解决利用工程菌合成异戊二烯效率不高的技术问题，提供一种具有较高合成效率的异戊二烯合成酶基因及应用。为达到上述目的，一种异戊二烯合成酶基因，其是如下(a)或(b)的基因：(a)所述基因cDNA的核苷酸序列如序列表的序列1所示；(b)所述基因是编码如下蛋白质的基因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。本专利技术同时提供一种异戊二烯合成酶基因表达的蛋白质，其是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质；序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质是由序列表的序列1所示碱基序列编码。本专利技术还提供一种异戊二烯合成酶基因的原核表达载体。本专利技术还提供异戊二烯合成酶基因原核表达载体的产异戊二烯工程菌。本专利技术同时提供产异戊二烯工程菌在制备异戊二烯中的应用。本专利技术的有益效果：根据植物在自然界异戊二烯的释放速率，本专利技术选择了释放量较高的夏橡异戊二烯合成酶基因进行了分离鉴定和克隆，成功构建异戊二烯生产菌株，为生物法生产异戊二烯寻找到一个高效的异戊二烯合成酶。本专利技术利用基因工程手段，克隆得到了夏橡基因QrIspS，应用到大肠杆菌中，使用气相色谱进行检测，大肠杆菌具备生产异戊二烯的能力，本专利技术对于使用微生物进行异戊二烯大规模工业生产提供了一个高效有效的酶。附图说明图1是夏橡总RNA的琼脂糖电泳结果；图2是夏橡QrIspS基因片段的琼脂糖电泳结果；图3是夏橡QrIspS基因3’-RACE的琼脂糖电泳结果；图4是夏橡QrIspS基因5’-RACE的琼脂糖电泳结果；图5是夏橡QRISPS氨基酸序列BlastP分析结果图；图6是RACE原理图；图7是夏橡QRISPS蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE结果；图8是异戊二烯标准品的气相色谱结果；图9是夏橡QrIspS基因在大肠杆菌中应用的气相检测结果；图10是夏橡QRISPS蛋白经过取代突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结果；图11是夏橡QRISPS蛋白经过添加突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结果；图12是夏橡QRISPS蛋白经过缺失突变之后在大肠杆菌中应用的气相检测结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，大肠杆菌BW25113(Baba T et al.Mol Syst Biol.2006；2:2006.0008.)是一株非病原菌，遗传背景清楚，世代时间短、容易培养且培养基原料低廉。大肠杆菌BW25113公众可从中国科学院微生物研究所获得，以上所述生物材料只为重复本专利技术的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例1：基因片段的获得1.提取夏橡叶片总RNA采集夏橡叶片，使用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen公司)提取杨树叶片总RNA，按照试剂盒说明方法进行，进行电泳(图1)验证RNA提取质量，可见RNA完整性良好，可以进行后续实验。2.RT-PCR以Oligo(dT)20做为反转录引物，按照反转录试剂盒SuperScript.III First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen公司)说明将核酸反转录为cDNA；反应体系如下：RNA 1μg10mM dNTP 1μlOligo(dT)20(0.5μg/μl) 1μl65℃5min，置于冰上1min，加入下面的10μl的mix50℃50min，85℃15min加入1μl RNase H，37℃20min反应完毕，加入100μl水稀释cDNA，得到cDNA第一链。3.简并引物设计根据杨柳科及豆科植物的已知氨基酸序列的保守区，并且参考所有已知IspS的核酸序列及单萜合成酶的核酸序列设计的简并引物QRF1及QRR1：QRF1：5'ATCATHGAYGAYATHTAYGAYGT 3'QRR1：5'YTGRTANGTGCARTGNGA 3'4.简并PCR反应反应体系反应条件：扩增出672bp左右的片段(图2)，扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶上电泳，产物单一明亮。备注：所示明亮单一条带为QRF1和QRR1引物组扩增产物，Marker为TAKARA 100bp DNA Ladder。5.连接T载体，Sanger测序将单一明亮的条带回收，连接PMD18-T(TAKARA公司)载体，转化至trans5α(TransGen公司)感受态细胞，第二天选择白斑进行验证，选取阳性克隆，送至生工Sanger测序。6.测序及序列分析，测序结果经序列比对，显示该基因为Isoprenoid_Biosyn_C1superfamily成员，与川桑(Morus notabilis)的异戊二烯合成酶有68％同源性，与苹果(Malus domestica)的β罗勒烯合成酶有67％的同源性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种异戊二烯合成酶基因，其特征是如下(a)或(b)的基因：(a)所述基因cDNA的核苷酸序列如序列表的序列1所示；(b)所述基因是编码如下蛋白质的基因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种异戊二烯合成酶基因，其特征是如下(a)或(b)的基因：(a)所述基因cDNA的核苷酸序列如序列表的序列1所示；(b)所述基因是编码如下蛋白质的基因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有异戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨基酸序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。2.如权利要求1所述的异戊二烯合成酶基因表达的蛋白质，其特征是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表的序列2所示...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春，赖小勤，冯凡，毋鸿江，傅深展，陶勇，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，中科鸿基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11