一种产异丁醇和乙醇的大肠杆菌及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种产异丁醇和乙醇的大肠杆菌及其制备方法。本发明专利技术提供了一种构建生产异丁醇和/或乙醇重组菌的方法，包括如下步骤：1)在大肠杆菌AS108中表达乙醇脱氢酶基因adhE和丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因pflB，得到命名为A的重组菌；2)降低所述命名为A的重组菌中的乙醇脱氢酶和/或提高所述命名为A的重组菌中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的酶活性，得到命名为B的重组菌。本发明专利技术的实验证明，本研究将通过在AS108菌株中引入乙醇生产途径来消耗掉过多的NADH，减少其积累对细胞造成的毒性；同时，激活磷酸戊糖途径(Pentose phosphate pathway，PPP途径)来提高NADPH的供给，从而改善异丁醇的生产能力。

Escherichia coli producing ISO butanol and ethanol and preparation method thereof

The invention discloses an Escherichia coli producing ISO butanol and ethanol and a preparation method thereof. The present invention provides a method for constructing isobutanol and / or ethanol production of recombinant bacteria, which comprises the following steps: 1) the expression of pflB gene encoding alcohol dehydrogenase gene adhE and pyruvate formate lyase in Escherichia coli AS108, was named the recombinant bacteria A; 2) reduce the recombinant bacteria named A the alcohol dehydrogenase and / or improve the named 6- activity of glucose-6-phosphate dehydrogenase of recombinant bacteria in A, has been named the recombinant bacteria B. The experiment of this study will be introduced by the way of ethanol production in the AS108 strains to consume too much NADH, reduce the accumulation of cells caused by the toxicity; at the same time, the activation of the pentose phosphate pathway (Pentose phosphate pathway, PPP pathway) to improve NADPH supply, so as to improve the production of isobutanol ability.

【技术实现步骤摘要】
一种产异丁醇和乙醇的大肠杆菌及其制备方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种产异丁醇和乙醇的大肠杆菌及其制备方法。
技术介绍
目前全球的液体运输燃料基本都是以石油为原料炼制的。这些燃料燃烧后会生成大量的温室气体，使全球的温度升高。而全球变暖会引起一系列问题，如海平面上升、亚热带地区沙漠膨胀、冰川融化、冻土解冻、北极雨林和北方森林的面积缩小、海啸和飓风密度增加、物种灭绝等。生物质是一种广泛存在且可再生的清洁资源。通过生物制造法，生物质可以被转化为可再生的替代能源。近几十年来，生物能源的研究开发主要集中在乙醇、丁醇、沼气、氢气和生物柴油等。醇类物质由于其具有的易燃性以及可以与汽油混合等优点，被认为是未来汽油燃料的理想替代品。其中，乙醇是目前研究最成熟、利用微生物进行生产并且实现产业化的可再生能源。但是，乙醇燃料具有很多潜在的问题。而与乙醇相比，长链醇作为燃料具有更多的优势，如其能量密度高，和汽油基本相同；亲水性低，可与汽油高比例混合；能利用现有石油管道进行运输；能降低混合燃料的蒸汽压，操作更安全等。异丁醇作为长链醇的典型代表，其生物合成早已受到广泛重视。另外，除了作为燃料，异丁醇还可以直接用作溶剂，也可以转化为异丁烯。异丁烯是重要的化工原料，可以用于制备丁基橡胶、聚异丁烯和合成橡胶等。同时，异丁醇在化工市场上也有很多用途，主要用于生产润滑油添加剂、表面涂料、粘合剂等复合溶剂，同时还可以用于生产邻苯二甲酸酯类增塑剂。自然界中仅有个别微生物(例如酿酒酵母)能产少量的异丁醇。近几年来，美国杜邦公司、美国Gevo公司在构建基因工程菌发酵生产异丁醇方面进行了深入的研究。杜邦公司通过利用支链氨基酸的生物合成途径和Ehrlich途径，首次在大肠杆菌中创建了异丁醇的生物合成途径，并申请了相关专利。美国加州大学洛杉矶分校的JamesC.liao课题组，通过缬氨酸合成的中间代谢物2-酮基异戊酸来生产异丁醇。该研究小组通过在大肠杆菌中敲除乙醇脱氢酶基因adhE、乳酸脱氢酶基因ldhA、富马酸还原酶基因frd、转录调控因子fnr、磷酸乙酰转移酶基因pta、丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB；过表达异丁醇合成途径中的关键基因来自枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合酶基因alsS，大肠杆菌来源的醇酮酸还原异构酶基因ilvC，二羟基酸脱水酶基因ilvD，2-酮酸脱羧酶基因kivD和醇脱氢酶基因adhA，获得菌株JCL260。该菌株微氧发酵122h可以生产22g/L的异丁醇，转化率达到86％。在用1L发酵罐进行好氧发酵并用汽提法收集时，发酵72h可以生产50g/L的异丁醇。2009年，该课题组用聚球藻(SynechococcuselongatusPCC7942，S.elongatusPCC7942)发酵生产异丁醇。结果显示，发酵6天可以生产450mg/L异丁醇。Jin-HoSeo利用酵母菌(Saccharomycescerevisiae，S.cerevisiae)作为表达宿主，采用微氧的发酵方式可以生产151mg/L的异丁醇。BernhardJ.Eikmanns用谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum，C.glutamicum)作为宿主菌，采用两步法发酵生产异丁醇。结果异丁醇产量达到175mM，糖醇转化率达到48％。闻建平等利用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)进行好氧发酵，可以生产0.607g/L异丁醇。目前报道的异丁醇工程菌绝大多数采用好氧工艺。好氧工艺在生产过程中需要用空气，能耗很大；更关键的是，有相当一部分碳源进入三羧酸循环(TCA)循环被用于细胞生长，导致转化率比理论最大值要低很多。厌氧工艺和好氧相比，具有低能耗、高转化率的优点，生产过程中不需要通空气，大大节约能耗；产品的转化率通畅接近理论最大值。因此在生产生物能源和大宗化学品等低价值产品时，非常有必要使用厌氧发酵工艺。厌氧条件下，葡萄糖转化为异丁醇的理论最大转化率是1mol/mol。然而，异丁醇合成途径存在的氧化还原问题导致目前的工程菌很难达到理论最大转化率。从丙酮酸到异丁醇的合成途径需要消耗2个还原力，一个是将乙酰乳酸还原为2,3-二羟基-3-甲基丁酸，由乙酰羟基酸还原异构酶IlvC催化，该酶是NADPH依赖型；另一个是将异丁醛转化为异丁醇，由醇脱氢酶催化，该酶既有NADH依赖型，也有NADPH依赖型。但是，在厌氧发酵时，葡萄糖的代谢主要是通过糖酵解途径(EMP途径)，1mol葡萄糖代谢生产2mol丙酮酸的同时，会生成2molATP和2molNADH。因此，这就导致了厌氧条件下生产异丁醇的代谢工程改造的大肠杆菌中出现氧化还原力供给不平衡的问题，即NADH过剩，而NADPH供给不足。目前已经有多种方法用于改造大肠杆菌使其能够在厌氧条件下生产异丁醇。如通过定向进化将酰羟基酸还原异构酶IlvC和醇脱氢酶Adh的由NADPH依赖型改造成NADH依赖型，从而在微氧发酵时能够获得理论转化率。另外，石爱琴等报道，同时激活转氢酶PntAB和NAD激酶YfjB可以将厌氧条件下异丁醇的转化率由0.66提高到0.92mol/mol。另外计算机模拟显示，将异丁醇设计大肠杆菌厌氧发酵时的唯一产物是不可行的，该途径必须与能够氧化NADH的途径相结合获得的菌株才能同时支持细胞生长和异丁醇生产。由此设计的菌株在厌氧条件下能够生产1.72g/L的异丁醇。但该方法只解决了NADH过剩的问题，而未解决NADPH供给不足的问题。大肠杆菌有三种途径来合成NADPH：磷酸戊糖途径、TCA循环和转氢酶。在好氧条件下，磷酸戊糖途径和TCA循环分别贡献了35-45％和20-25％的NADPH，而转氢酶贡献了35-45％的NADPH。在厌氧条件下，磷酸戊糖途径和TCA循环的活性很低，基本上所有的NADPH都通过转氢酶来供给，但由于其活力有限，并不能满足异丁醇生产的需求。大肠杆菌工程菌株AS108是前期构建的能够生产异丁醇的工程菌株。该菌株在厌氧条件下发酵时，能够生产35mM的异丁醇，转化率为0.66mol/mol，但是厌氧发酵中还存在的氧化还原力供给不平衡问题。
技术实现思路
为了进一步优化AS108菌株中异丁醇的生产效率并解决厌氧发酵存在的氧化还原力供给不平衡问题，进行如下：本专利技术的一个目的是提供一种构建生产异丁醇和/或乙醇重组菌的方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤：1)在大肠杆菌AS108中表达乙醇脱氢酶基因adhE和丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因pflB，得到命名为A的重组菌；2)降低所述命名为A的重组菌中的乙醇脱氢酶和/或提高所述命名为A的重组菌中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的酶活性，得到命名为B的重组菌。上述方法中，步骤1)中，所述在大肠杆菌AS108中表达乙醇脱氢酶基因adhE和丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因pflB为将所述乙醇脱氢酶基因adhE和所述丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因pflB导入所述大肠杆菌AS108。上述方法中，步骤2)中，所述降低命名为A的重组菌中的乙醇脱氢酶的酶活性为将所述命名为A的重组菌基因组中的乙醇脱氢酶编码基因调控元件替换为RBSL调控元件5、RBSL调控元件6、RBSL调控元件7或RBSL调控元件8；所述提高命名为A的重组菌中的6-磷酸葡萄糖脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建生产异丁醇和/或乙醇重组菌的方法，包括如下步骤：1)在大肠杆菌AS108中表达乙醇脱氢酶基因adhE和丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因pflB，得到命名为A的重组菌；2)降低所述命名为A的重组菌中的乙醇脱氢酶和/或提高所述命名为A的重组菌中的6‑磷酸葡萄糖脱氢酶的酶活性，得到命名为B的重组菌。

【技术特征摘要】
1.一种构建生产异丁醇和/或乙醇重组菌的方法，包括如下步骤：1)在大肠杆菌AS108中表达乙醇脱氢酶基因adhE和丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因pflB，得到命名为A的重组菌；2)降低所述命名为A的重组菌中的乙醇脱氢酶和/或提高所述命名为A的重组菌中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的酶活性，得到命名为B的重组菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述在大肠杆菌AS108中表达乙醇脱氢酶基因adhE和丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因pflB为将所述乙醇脱氢酶基因adhE和所述丙酮酸甲酸裂解酶的编码基因pflB导入所述大肠杆菌AS108。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述降低命名为A的重组菌中的乙醇脱氢酶的酶活性为将所述命名为A的重组菌基因组中的乙醇脱氢酶编码基因调控元件替换为RBSL调控元件5、RBSL调控元件6、RBSL调控元件7或RBSL调控元件8；所述提高命名为A的重组菌中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶的酶活性为将所述命名为A的重组菌基因组中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶编码基因调控元件替换为RBSL调控元件1、RBSL调控元件2、RBSL调控元件3或RBSL调控元件4；所述RBSL调控元件1的核苷酸序列为序列6第54-142位核苷酸；所述RBSL调控元件2的核苷酸序列为序列7第54-142位核苷酸；所述RBSL调控元件3的核苷酸序列为序列8第54-142位核苷酸；所述RBSL调控元件4的核苷酸序列为序列9第54-142位核苷酸；所述RBSL调控元件5的核苷酸序列为序列12第5...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，刘萍萍，刘子纯，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12