一种表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建及发酵方法技术
Construction of non antibiotic resistant recombinant Bacillus subtilis expressing glutamic acid decarboxylase and fermentation method thereof
The invention relates to the construction and fermentation method of an antibiotic free recombinant Bacillus subtilis expressing glutamic acid decarboxylase, which belongs to the technical field of biological engineering. The Bacillus subtilis WB600 strain, knockdown of D alanine racemase gene on its chromosome (
【技术实现步骤摘要】
一种表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建及发酵方法
本专利技术涉及一种表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建及发酵方法，属于生物工程
技术介绍
伽马氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，广泛分布在动植物体中，研究发现，伽马氨基丁酸具有改善心血管，治疗神经疾病，改善肝肾功能和调节内分泌系统等重要作用，因此它在药物治疗和功能性食品方面具有广阔的应用前景。制备伽马氨基丁酸的方法主要有化学法、动植物富集法和微生物合成法三大类方法。化学合成法在生产中使用了有毒的化学试剂，生产得到的伽马氨基丁酸不能添加到食品中；而伽马氨基丁酸在动植物中含量很低，通过植物富集法来得到伽马氨基丁酸面临着成本过高的问题；微生物合成法是指利用微生物细胞内含有的谷氨酸脱羧酶生物催化L-谷氨酸钠(L-MSG)发生脱羧反应制备伽马氨基丁酸。采用乳酸菌等野生菌发酵生产伽马氨基丁酸面临着培养周期长、产酶效率低、分离提纯步骤复杂等缺点；用大肠杆菌表达外源谷氨酸脱羧酶虽然酶活能大大提高，但由于大肠杆菌是革兰氏阴性菌，在发酵过程中会产生内毒素，所以利用大肠杆菌为...
【技术保护点】
一株表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（
【技术特征摘要】
1.一株表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）SK44.001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2016774，其为将重组质粒pUB-HpaII-P43-gad-dal导入宿主细胞WB600(dal-)而得到，其组成为WB600/pUB-HpaII-P43-gad-dal，其能够合成氨基酸序列SEQIDNo.1的谷氨酸脱羧酶。2.一种谷氨酸脱羧酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。3.权利要求2所述的谷氨酸脱羧酶的编码基因，其特征在于：所述的谷氨酸脱羧酶的编码基因来源于密码子优化后的乳酸乳球菌Lactococcuslactissubsp.lactisIL1403的gad基因序列，原始gad核酸序列如SEQIDNo.2所示，优化后的gad核酸序列如SEQIDNo.3所示。4.权利要求1所述表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述的重组质粒pUB-HpaII-P43-gad-dal，包含了含有所述优化后的gad核酸序列SEQIDNO.3和pUB-HpaII-P43-dal中核酸序列SEQIDNo.4。5.权利要求1所述表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：（1）宿主细胞WB600(dal-)的构建：WB600(dal-)是D-丙氨酸消旋酶基因缺陷的枯草芽孢杆菌，（a）在枯草芽孢杆菌WB600染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因(dal)的上下游各选取900bp长度的片段作为同源臂，通过PCR将两段同源臂扩增，并胶回收；选取lox71-spc-lox66抗性基因片段作为筛选标记，将上下游同源臂和lox71-spc-lox66片段通过融合PCR将三段基因连接在一起；将PCR产物转入枯草芽孢杆菌WB600感受态中，在含有壮观霉素Spc的平板上筛选；由于同源臂的存在，发生同源重组，敲除枯草芽孢杆菌WB600染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因dal，得到D-丙氨酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：江波，沐万孟，丁汪洋，张涛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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