一种重组大肠杆菌及其构建方法与通过代谢工程生产葡萄糖二酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种重组大肠杆菌及其构建方法与通过代谢工程生产葡萄糖二酸的方法，属于代谢工程领域。本发明专利技术通过在大肠杆菌中表达来源于植物的肌醇‑1‑磷酸合成酶基因（Ino1）、肌醇氧化酶基因（MIOX），实现葡萄糖醛酸的生产途径，同时表达来源于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的醛酸脱氢酶基因（Udh），成功构建葡萄糖二酸的合成途径。其中，重组大肠杆菌在LB‑G（LB培养基中加入10g/L葡萄糖）发酵培养基中生成葡萄糖二酸2.53g/L。本发明专利技术提出的重组大肠杆菌发酵生产葡萄糖二酸的方法，具有广阔的发展前景，为生物合成葡萄糖二酸奠定基础。

Recombinant Escherichia coli and construction method thereof and process for producing gluconic acid by metabolic engineering

The invention discloses a recombinant Escherichia coli and a construction method thereof, and a method for producing gluconic acid through metabolic engineering, belonging to the field of metabolic engineering. The 1 phosphate synthase gene in Escherichia coli from plant inositol (Ino1) and inositol oxidase gene (MIOX), the production of glucuronic acid, while the expression derived from Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium tumefaciens) acid dehydrogenase gene (Udh), synthetic approach to constructing glucarate the. The recombinant Escherichia coli LB (G in 10g/L glucose LB medium) fermentation culture medium for 2.53g/L generation glucarate. The method for producing glucose diacid by recombinant Escherichia coli has broad prospect and lays the foundation for biosynthesis of glucose diacid.

【技术实现步骤摘要】
一种重组大肠杆菌及其构建方法与通过代谢工程生产葡萄糖二酸的方法
本专利技术属于代谢工程领域，具体涉及一种重组大肠杆菌及其构建方法与通过代谢工程生产葡萄糖二酸的方法。
技术介绍
葡萄糖二酸(glucuricacid,saccharicacid)又名葡萄糖质酸，是含有4个手性碳原子的化合物，通常以手性化合物D-葡萄糖二酸的形式存在，在水溶液中自发氧化，形成单内酯D-葡萄糖二酸-1,4内酯和D-葡萄糖二酸-3,6-内酯以及少量的双内酯D-葡萄糖二酸-1,4；3,6-内酯。葡萄糖二酸是一种天然、无毒的化合物，少量生产于包括人类的哺乳动物和一些植物中，如番茄、葡萄柚等。葡萄糖二酸具有重要的生物功能，被美国能源部确定为“最有价值的生物炼制产品”。它和许多营养物质一样，可以帮助和增强免疫及身体排毒，进而减少人类疾病，研究称葡萄糖二酸有药理作用，它能特异性的强烈抑制一些与癌症发生有关的酶如β-葡萄糖醛酸苷酶的活性。它还可以降低胆固醇，同时其钙盐也是一种食品添加剂。葡萄糖二酸及其衍生物能明显抑制凝血酶诱导花生四烯酸过氧化反应，可以起到明显的抗炎症作用；葡萄糖二酸及其衍生物影响血小板在氧化应激条件的活化，通过抗氧化机制有助于预防过度血小板激活，因此葡萄糖二酸及其衍生物可能是预防心血管疾病风险的顶尖保健品，而一些水果蔬菜中含有大量的葡萄糖二酸及其衍生物，可作为膳食预防心血管疾病风险。葡萄糖二酸由于对人体无毒，其结构与单糖结构相似，可以通过人体的糖转运系统进入细胞内部，且能够聚集在病灶和少量被缺血组织快速吸收等优点，因此可以作为显像剂应用于心肌梗死和肿瘤的研究中。另外，葡萄糖二酸也可应用于生活生产中普遍用到的聚合物单体的生产中，且这些聚合物在自然界中水解为小分子单体可以被植物和微生物吸收利用，所以它作为合成多种高效环保的新兴生物质能源的原料，具有巨大的潜在经济价值。目前葡萄糖二酸的制备方法主要是化学法，以硝酸氧化法和TEMPO为催化剂的氧化法等。硝酸氧化法主要将葡萄糖氧化为葡萄糖及小分子物质。此种方法生产的副产物多且复杂，同时有大量NO和NO2等有害气体排放，对环境产生污染，所以逐渐被新方法替代。TEMPO氧化法是指利用2,2,6,6-四甲基-1-哌啶自由基(TEMPO)介导的电化学氧化葡萄糖合成葡萄糖二酸的方法。由于它摧毁的氧化反应物金属参与反应且反应条件温和，对产物具有选择性并能够限制不可回收的副产物的产物，便于操作，是目前常用的一种方法；但是由于在反应过程中要控制反应温度和pH值以达到最佳，还有昂贵的催化剂也是需要改进的方面。长期以来，微生物发酵法来实现有机酸高效环保生产的常用方法。同化学法相比，微生物发酵法在原料损耗、产品纯度等方面有很大改善，成为一种更优的合成方法。葡萄糖二酸是存在于哺乳动物体内作为代谢终产物被发现，在体内，从葡萄糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反应。Prather等从酿酒酵母(Saccaromycescerevisiae)和小鼠获取肌醇-1-磷酸合成酶(Ino1)和肌醇氧化酶(MIOX)，及丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)获得醛酸脱氢酶(Udh)，克隆到大肠杆菌中，实现了葡萄糖二酸的生物合成。目前尚未发现有通过重组植物来源的肌醇氧化酶的大肠杆菌来发酵生产葡萄糖二酸的报道，植物中葡萄糖二酸含量少，且提取分离纯化较难，鉴于此，本专利技术中构建的植物来源基因异构重组在大肠杆菌，在微生物发酵生产葡萄糖二酸方面，提供了新的方法与思路。
技术实现思路
本专利技术通过将不同植物来源的肌醇-1-磷酸合成酶基因(Ino1)、肌醇氧化酶基因(MIOX)及来源于根癌农杆菌的醛酸脱氢酶基因(Udh)克隆表达至大肠菌株中，构建重组菌，该重组菌能以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物合成葡萄糖二酸。本专利技术通过以下技术方案实现。一种重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌同时表达肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇氧化酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh。优选的，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1来源于以下任意一种：酿酒酵母(Saccaromycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、番茄(SolanaceaeLycopersicon1706)、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)。进一步优选的，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1，在本专利技术的一种实施方式中，来源于番茄(SolanaceaeLycopersicon1706)。优选的，所述肌醇氧化酶基因MIOX来源于以下任意一种：毕赤酵母(PichiapastorisGS115)、番茄(SolanaceaeLycopersicon1706)、玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)。进一步优选的，所述肌醇氧化酶基因MIOX，在本专利技术的一种实施方式中，来源于番茄(SolanaceaeLycopersicon1706)。优选的，所述醛酸脱氢酶基因Udh来源于根癌农杆菌(AgrobacteriumtumefaciensGV3103)。优选的，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇氧化酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh，在本专利技术的一种实施方式中，其核苷酸序列分别是SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示的序列。优选的，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇氧化酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh表达的蛋白质，在本专利技术的一种实施方式中，其氨基酸序列分别是SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示的序列。优选的，所述重组大肠杆菌的出发宿主菌为大肠杆菌。优选的，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇氧化酶基因MIOX及醛酸脱氢酶基因Udh为整合表达。以上所述的重组大肠杆菌的构建方法，所述方法包括如下步骤：(1)将肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1和肌醇氧化酶基因MIOX连接到双元表达载体上转化到大肠杆宿主菌种，得到重组大肠杆菌1；(2)将醛酸脱氢酶基因Udh连接到表达载体后转化到步骤(1)得到的重组大肠杆菌1中，得重组大肠杆菌。优选的，该方法具体包括如下步骤：(1)以番茄(SolanaceaeLycopersicon1706)基因组为模板扩增MIOX基因、Ino1基因，并分别加上合适酶切位点，将片段连接到双元表达载体pETDuet1后，用化学法转化DH5α中，筛选获得正确的重组质粒，命名为pETDuet1-Ino1-MIOX，将重组质粒转化到宿主菌E.coliBL21(DE3)中既得到E.coliBL21(DE3)/Ino1-MIOX；(2)以根癌农杆菌(AgrobacteriumtumefaciensGV3103)基因组为模板扩增Udh基因，连接到pET28a后，用化学法转化步骤(1)构建的表达宿主E.coliBL21(DE3)/Ino1-MIOX中，筛选正确的重组大肠杆菌，命名为E.coliBL21(DE3)/Ino1-MIOX-Udh。一种利用所述以上重组大肠杆菌生产葡萄糖二酸的方法，该方法是以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物催化合成葡萄糖二酸。优选的，所述方法具体是将重组大肠杆菌种子液以2％-5％的接种量接种到发酵培养基中，于OD600约为0.6，加入终浓度为0.1-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达肌醇‑1‑磷酸合成酶基因Ino1、肌醇氧化酶基因MIOX和醛酸脱氢酶基因Udh。

【技术特征摘要】
1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌同时表达肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇氧化酶基因MIOX和醛酸脱氢酶基因Udh。2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1来源于酿酒酵母、毕赤酵母、番茄、玉米和大豆中的任意一种；所述肌醇氧化酶基因MIOX来源于酿酒酵母、毕赤酵母、番茄、玉米和大豆中的任意一种；所述醛酸脱氢酶基因Udh来源于根癌农杆菌。3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇氧化酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh的核苷酸序列分别是SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示的序列。4.根据权利要求1或3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌的出发宿主菌为大肠杆菌。5.根据权利要求1或3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇氧化酶基因MIOX及醛酸脱氢酶基因Udh为整合表达。6.一种权利要求1或3所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）将肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1和肌醇氧化酶基因MIOX连接到双元表达载体上转化到大肠杆宿主菌种，得到重组大肠杆菌1；（2）将醛酸脱氢酶基因Udh连接到表达载体后转化到步骤（1）得到的重组大肠杆菌1中，得重组大肠杆菌。7.根据权利要求6所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：娄文勇，苏慧慧，宗敏华，徐培，杨继国，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44