一种大肠杆菌分泌表达外源蛋白的质粒载体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种大肠杆菌分泌表达外源蛋白的质粒载体及其构建方法。具体地，本发明专利技术公开了一种重组分泌型表达载体，该载体含有碱性磷酸酶PhoA分泌信号肽及多聚组氨酸序列，能够在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达外源重组蛋白。本发明专利技术还公开了上述表达载体的构建、PhoA引导肽‑外源蛋白融合基因克隆及融合蛋白表达与检测技术。该载体能使外源蛋白在胞外稳定表达，从而可应用于常规蛋白的分泌表达。

Plasmid vector for secretion and expression of exogenous protein by Escherichia coli and construction method thereof

The invention discloses a plasmid vector for secretion and expression of an exogenous protein of Escherichia coli and a construction method thereof. Specifically, the invention discloses a recombinant secretory expression vector, the vector containing alkaline phosphatase PhoA secretion signal peptide and polyhistidine sequence in Escherichia coli BL21 induced by IPTG for expression of exogenous recombinant protein. The present invention also discloses the expression vector construction, PhoA guide peptide heterologous protein fusion gene and protein expression and detection technology. The vector can make the foreign protein stably expressed outside the cell, thus can be applied to the secretion and expression of conventional proteins.

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌分泌表达外源蛋白的质粒载体及其构建方法
本专利技术涉及用于蛋白的表达与纯化
，具体是涉及分泌表达外源蛋白的质粒载体及其构建方法。技术背景蛋白的表达纯化技术在酶与活性蛋白的低成本提取、蛋白功能研究、蛋白结构分析等多个领域有着较为重要的应用。对所纯化的蛋白最基本的要求是蛋白能较好的分散于相应溶液并具备良好的生物活性。目前常规的表达载体多数基于大肠杆菌胞内表达技术，其优点是大肠杆菌易于培养和破碎，有利于蛋白的纯化。不足是所表达外源蛋白局限于细胞内部，由于空间所限可溶部分的蛋白产量有限，且有很多蛋白因此在胞内形成聚集或包涵体，需要做进一步的变、复性处理。而聚集或包涵体形式的蛋白往往由于各种分子修饰作用，难以重新分散于合适的体系。在寻找复性条件时需要更多的条件摸索过程因而形成成本消耗。
技术实现思路
专利技术人通过克隆技术引入碱性磷酸酶PhoA的信号肽序列构建了能够分泌至大肠杆菌细胞外的外源蛋白表达载体，该载体具备Lac诱导表达系统、PhoA信号肽、多克隆位点、多聚组氨酸标签以及T7终止子，实验验证了外源蛋白的诱导分泌表达能力。因此，本专利技术为胞外活性外源蛋白的提取提供了一种新的表达载体。因此，本专利技术提供了一种以PhoA信号肽引导蛋白分泌表达的大肠杆菌克隆表达质粒载体，所述质粒载体含有Lac操纵子-碱性磷酸酶PhoA引导肽-TEV（烟草蚀蚊病毒蛋白酶）识别位点-多克隆位点-多聚组氨酸肽基因序列。在一个优选的实施方案中，所述多克隆位点是源于pET22b质粒、位于TEV酶识别序列下游的NcoI至XhoI等系列限制性内切酶识别序列。在一个优选的实施方案中，所述多聚组氨酸肽的长度是6个氨基酸。优选地，多聚组氨酸肽基因序列后有T7终止子序列。优选地，所述质粒载体以质粒pET22b（例如其序列为SEQIDNO.3）构建。在一个实施方案中，所述质粒载体的序列是SEQIDNO.6。在一个实施方案中，本专利技术还提供了含有本专利技术的表达质粒载体的宿主菌，例如大肠杆菌BL21。在一个实施方案中，所述质粒载体的序列是SEQIDNO.6。在一个实施方案中，本专利技术还提供了一种构建分泌型融合蛋白的表达质粒载体的方法，所述方法通过PCR扩增技术、限制性内切酶切割和T4连接酶连接，在本专利技术的表达质粒载体的多克隆位点上插入待表达的外源蛋白肽段基因序列。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种诱导分泌型外源蛋白表达的方法，其中本专利技术的方法构建的分泌型外源蛋白的表达质粒载体在宿主菌受到IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导后表达。在一个具体实施方案中，所述外源蛋白是表面免疫相关蛋白Sip蛋白。在一个具体实施方案中，含所述表面免疫相关蛋白Sip蛋白的表达质粒载体具有SEQIDNO.9的序列。在一个具体的实施方案中，一种检测分泌型外源蛋白方法，其中本专利技术的表达质粒载体表达的外源蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳方法检测到。在一个具体实施方案中，所述外源蛋白是表面免疫相关蛋白Sip蛋白。在一个具体实施方案中，含所述表面免疫相关蛋白Sip蛋白的表达质粒载体具有SEQIDNO.9的序列。在一个具体的实施方案中，用本专利技术的表达质粒载体表达的外源蛋白能有效分泌至胞外，提高可溶外源蛋白的产量和得率。在一个具体实施方案中，所述外源蛋白是表面免疫相关蛋白Sip蛋白。在一个具体实施方案中，含所述表面免疫相关蛋白Sip蛋白的表达质粒载体具有SEQIDNO.9的序列。本专利技术针对目前大肠杆菌中表达的外源蛋白多为胞内蛋白，从而部分蛋白易于形成包涵体、不利于纯化的问题，设计和构建了在大肠杆菌胞外表达外源蛋白的质粒载体。该载体在商业质粒pET22b的基础上引入碱性磷酸酶PhoA的信号肽，在其下游设计多克隆位点，TEV酶识别切割序列和用于蛋白纯化的多聚组氨酸肽段，实现外源蛋白基因的插入、外源蛋白的分泌表达和活性蛋白的提取。由于采用Lac诱导系统，在IPTG诱导的条件下即可启动外源蛋白的高效表达。该质粒表达体系为外源蛋白的表达和纯化提供新的材料。附图说明：图1为PhoA-Sip融合蛋白表达的SDS-PAGE凝胶电泳图。样品顺序为：M：分子量标记（单位：kDa）。1-3：诱导前的菌液上清(1)、菌体破碎沉淀(2)、菌体破碎上清(3)；4-6：诱导后的菌液上清(4)、菌体破碎沉淀(5)、菌体破碎上清(6)；7、8为不含质粒的BL21全菌（两个重复）。图2：商业大肠杆菌表达质粒pET22b中用于外源蛋白基因克隆及表达的主要元件。图3：表达质粒中用于外源蛋白基因克隆表达的元件示意图。图4：测得序列与设计的质粒pET22b-PhoA预测序列做blast比较的结果。图5：将测得序列与含PhoA-Sip序列的融合基因的预测序列做blast比较的结果。具体实施方式下面将结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式做进一步详细描述。以下实施例将有助于说明本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。1.pET22b-PhoA的构建设计上游引物pET22b_phoA-S:GGAATTCCATATGAAACAAAGCACTATTGC(5’-3’)（SEQIDNO.1），和下游引物pET22b_phoA-AS:CATGCCATGGCTCCCTGAAAATACAGGTTTTCGGCTTTTGTCACAGGG(5’-3’)（SEQIDNO.2），以PhoA的基因模板扩增PhoA信号肽基因序列，除了PhoA信号肽的相应匹配序列以外，上游引物带有NdeI酶切位点（连接了相应酶切保护碱基），下游引物带有NcoI酶切位点（连接了保护碱基）、以及TEV酶识别切割序列。扩增PhoA基因序列按PrimerStarHSDNA聚合酶(Takara)试剂盒说明书操作。用DNA琼脂糖凝胶电泳方法检测扩增基因片段大小，按照胶回收试剂盒（OMEGA）说明书回收基因，溶解于溶解液或无菌水。以NdeI和NcoI(Takara公司)分别对pET22b和所扩增的PhoA信号肽基因酶切，条件参照厂商提供的说明书进行。用DNA胶纯化方法提纯酶切后的片段，16℃下用T4连接酶对酶切后的载体和上述扩增的PhoA信号肽基因序列片段过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，具体方法参照《分子克隆》第三版的CaCl2热激转化法。以含有氨苄青霉素100μg/mL的LB平板（胰化蛋白胨10gL-1，酵母提取物5gL-1，NaCl10gL-1，琼脂粉20gL-1，下文LB培养基不含琼脂）对菌落在37℃下进行培养，16-24小时后以菌落PCR的方法对阳性菌落进行筛选。方法如下：准备200微升的PCR小管，加入5-10微升无菌水，以无菌枪头挑取菌落，打散至无菌水中，加入DreamTaqMM试剂盒（Takara）提供的等体积2×缓冲液和适量的DreamTaqMM聚合酶，在PCR仪中进行菌落PCR（引物分别是：pET22b_phoA-S；pET22b_phoA-AS），实验条件参照PCR酶试剂盒提供的说明书设置。用DNA琼脂糖凝胶电泳方法检测扩增的基因片段，将正确扩增结果对应的菌落经行培养，送至测序公司测序，以确保质粒的序列正确。抽提质粒保存于-80℃。大肠杆菌表达质粒pET22b为商业购买，全长5493bp，环状，序列如下（SEQIDNO.3）：AGATCTCGATCCCGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以PhoA信号肽引导表面免疫相关蛋白Sip蛋白分泌表达的大肠杆菌克隆表达质粒载体，所述表达质粒载体包含Lac操纵子‑PhoA引导肽‑TEV识别位点‑多克隆位点‑多聚组氨酸肽基因序列，所述表达质粒载体以质粒pET22b构建，所述质粒pET22b的序列为SEQ ID NO.3，所述表达质粒载体在序列SEQ ID NO.6的多克隆位点插入表面免疫相关蛋白Sip蛋白的基因序列，所述表达质粒载体具有SEQ ID NO.9的序列。

【技术特征摘要】
1.一种以PhoA信号肽引导表面免疫相关蛋白Sip蛋白分泌表达的大肠杆菌克隆表达质粒载体，所述表达质粒载体包含Lac操纵子-PhoA引导肽-TEV识别位点-多克隆位点-多聚组氨酸肽基因序列，所述表达质粒载体以质粒pET22b构建，所述质粒pET22b的序列为SEQIDNO.3，所述表达质粒载体在序列SEQIDNO.6的多克隆位点插入表面免疫相关蛋白Sip蛋白的基因序列，所述表达质粒载体具有SEQIDNO.9的序列。2.包含权利要求1所述的表达质粒载体的宿主菌。3.根据权利要求2所述的宿主菌，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌BL21。4.一种分泌型外源蛋白的表...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴允昆，张蕾，孙丽芳，赵艳和，吴秀玲，
申请(专利权)人：中国科学院福建物质结构研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35