本发明专利技术公开了一种不含外源DNA片段的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌及其制备方法和应用，(1)将GA2DH基因和PDC基因的上、下游片段分别引入重组整合型自杀质粒的多克隆位点，分别得自杀型敲除质粒pΔGOX1231和自杀型敲除质粒pΔGOX1081；(2)将pΔGOX1231电转化转入宿主菌中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取GA2DH基因敲除的阳性突变子G.oxydans ZJU1；(3)将pΔGOX1081电转化转入经传代后的G.oxydans ZJU1中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取PDC基因敲除的阳性突变子G.oxydans ZJU2。GA2DH是氧化葡萄糖酸形成2-KGA的主要酶，而PDC则与催化丙酮酸脱羧，形成乙醛相关，GA2DH和PDC的敲除可以解决5-KGA形成过程中的代谢分流，减少副产物，实现5-KGA的高产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种不含外源DNA片段的氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacteroxydans 基因工程菌及其应用，尤其是生产5-酬基-D-葡萄糖酸巧-keto-D-gluconicacid，5-KGA) 的工程菌及应用，属于基因工程及发酵工程
技术介绍
阳002] 氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans)621H能耐受高浓度的葡萄糖，并W 葡萄糖为底物，不完全氧化为葡萄糖酸（gluconicacid,GA)，进一步氧化为2-酬基-D-葡 萄糖酸（2-keto-D-gluconicacid, 2-KGA)或者5-酬基-D-葡萄糖酸巧-KGA)。是心(+)-酒 石酸的重要前体物质，早在1933年，Barch就报道了通过5-KGA化学催化制备k(+)-酒石 酸（JournalofAmericanQiemicalSociety, 1933, 55, 3563) ,1945 年Soltzberg等又申 请专利US2380196报道硝酸氧化5-KGA制备k(+)-酒石酸。然而由于当时5-KGA主要通 过葡萄糖脱氨制备，效率不高，因此通过微生物制备并获得5-KGA具有重要意义。 目前，在微生物制备5-KGA的研究中，主要W德国化lich研究中屯、为主。借W 基因工程手段，对提高5-KGA产量展开了大量研究，如GA2DH基因（葡萄糖酸-2-脱氨酶 (gluconate-2-dehy化ogenase)基因）的失活、GA5DH基因的过表达、表达启动子的改造 等。据报道，其 5-KGA的产量最高可达达 300mM，约 58. 2g/L(AppliedMicrobiologyand Biotechnology, 2006, 73 (2), 443-451)。近期，日本山 口大学Saichana等筛选到一株耐热 性Gluconobacter，并通过插入抗性基因失活GA2DH，最终5-KGA产量为190mM，约36. 86g/ L(AppiledandElnviromentalMicrobiology, 2009, 75(13), 4240-4247)。 而国内在生物质制备5-KGA研究尚处于起步阶段，主要研究重组氧化葡萄糖酸 杆菌的发酵培养条件，如初糖浓度、接种量、碳氮源等条件。如浙江大学李博义等研究 6.〇巧(1曰]18〔610： 1.637在恒定抑5.5，溶氧控制15%的条件下，流加补葡萄糖，最终 5-KGA产量达到75. 5g/l，转化率超过70 % (生物工程学报，2014, 30巧)，1486-1490);天津 科技大学谭之磊等W2-KGA缺陷型的GluconobacteroxydansHGI-1为出发菌株考察碳氮 源对5-KGA合成的影响，化发酵罐中进行分批发酵放大试验，5-KGA的产量为93. 80g/l，平 均生成速率为1. 56g/L?h(生物工程学报，2014, 30 (1)，76-82)。 阳0化]对工业应用的微生物进行基因修饰（geneticmodification,GM)是提升其应用潜 力的有效手段，W上对5-KGA产量的研究主要针对相关基因进行修饰。而基因修饰的安全 性最重要的方面包括基因的稳定性和表现型的可预测性。因此，应该尽量减少或避免生物 中所含转基因的数量和转基因的表达产物，主要包括：（1)激发外源DNA与其他基因组发生 融合的转座子；（2)抗生素抗性基因。 然而如何保证工程菌及其产物的安全性是构建GM微生物首先要考虑的问题。 自2001年1月18日，抑A发布了 "关于生物工程食品进入市场前的通告"（Premarket NoticeConcerningBioengineeredfloods,抑A, 2001a)，对建立GM生物的安全性提出了 一系列建议。FDA的法规 21C.F.R. § 170. 36 (见 62化d.Reg. 18, 938(April17, 1997))、欧 盟巧C)N〇1830/2003 法规W及犯CD:Safetyevaluationoffoodsderivedbymodern biotechnology,conceptsandprinciples中明确限定了GM生物及其产物的适用范围，仅 少数米曲霉（Aspergillusoryzae)、里氏木霉（Trichodermareesei)、米根霉（Miizopus oryzae)、黑曲霉（Aspergillusniger)及枯草芽抱杆菌度acillussubtilis)等GM微生 物，其生产的相关转基因产物可W在食品中应用。另外，W上法规中还专口规定了一种自克 隆微生物（Self-cloningorganism)在食品加工过程中的应用。典型就是葡萄酒酵母(wine yeast),其也是最早商业化在食品加工中使用的GM微生物（GMWineSold化1油elledin theUnitedStates,thisseries)。在 2006 年，美国FDA指定了另一种葡萄酒酵母ECM001 为GRAS微生物。其来源于啤酒酵母（SaccharomycescerevisiaeDavis522)，携带有 另外一株S.cerevisiae的DURl, 2基因、一个启动子和一个终止子（GRN000175 ：http：// WWW.fda.Rov/ucm/Rroups/fdaRov-public/ifdaRov-foods-Ren/documents/document/ucm268877.p壯)，通过表达尿素氨基水解酶来降低酿酒过程中的尿素。目前，在日本也同样支持自克隆GM在食品中应用。在Sake(-种米酒）酿造过程 中，通过基因组修饰，在不含外源DNA片段的前提下，表达Saccharomycescerevisiae的乙 酷基转移酶（acety]_-transferase)和乙醇己酷转移酶（ethanolhexanoy]_-transferase) 来强化芳香物质的形成，改善口感（ApplMicrobiolBiotechnol(2004)65:68 - 73)。因此， 在现有国际法规下，对于不含任何外源DM片段的GM微生物及其产物在食品中的应用持支 持的态度，也被认为是安全的。
技术实现思路
[000引本专利技术的目的在于针对现有5-KGA产量低及基因修饰微生物生物安全性的问题， 提供一种生产5-KGA的生物安全的氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacteroxydans基因工程菌 及其制备方法和应用。 一种不含外源DNA片段的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的制备方法，包括如下步 骤： (1)将GA2DH基因和PDC基因（丙酬酸脱簇酶（pyruvatedecarboxylase,)基因） 的上、下游片段分别引入重组整合型自杀质粒pJKM的多克隆位点，分别得到GA2DH基因的 自杀型敲除质粒PAG0X1231和PDC基因的自杀型敲除质粒PAG0X1081 ;所述重组整合型 自杀质粒带有SacB基因、抗生素标记和多克隆位点； (2)将所得自杀型敲除质粒PAG0X1231电转化转入宿主菌中，依次经抗生素抗性 筛选、无抗培养和薦糖筛选，然后通过菌落PCR获取GA2DH基因敲除的阳性突变子，命名为 G本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种不含外源DNA片段的氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将GA2DH基因和PDC基因的上、下游片段分别引入重组整合型自杀质粒pJKM的多克隆位点，分别得到GA2DH基因的自杀型敲除质粒pΔGOX1231和PDC基因的自杀型敲除质粒pΔGOX1081；所述重组整合型自杀质粒pJKM带有SacB基因、抗生素标记和多克隆位点；(2)将所得自杀型敲除质粒pΔGOX1231转入宿主菌中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取GA2DH基因敲除的阳性突变子，命名为G.oxydans ZJU1；(3)将所得自杀型敲除质粒pΔGOX1081转入经传代后的G.oxydans ZJU1中，依次经抗生素抗性筛选、无抗培养和蔗糖筛选，然后通过菌落PCR获取PDC基因敲除的阳性突变子，即得氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌，命名为G.oxydans ZJU2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：林建平，袁建锋，朱力，吴绵斌，杨立荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。