一种提高氧化葡萄糖酸杆菌同源重组效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高氧化葡萄糖酸杆菌同源重组效率的方法，属于基因工程领域。本发明专利技术在氧化葡萄糖酸杆菌中表达了外源重组酶，提高了菌株的同源重组效率，并通过构建带筛选标记的同源片段和不带筛选标记的同源片段，实现基因敲除和筛选标记的去除。所得表达了Red重组酶的氧化葡萄糖酸杆菌将在维生素C一步生产菌的构建中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】
一种提高氧化葡萄糖酸杆菌同源重组效率的方法
本专利技术涉及一种提高氧化葡萄糖酸杆菌同源重组效率的方法，属于基因工程领域。
技术介绍
氧化葡萄糖酸杆菌是维生素C经典两步发酵法的生产菌株之一，也是目前维生素C一步发酵法研究最具潜力的菌株。为了探究该菌维C相关代谢网络及有效利用各种代谢工程，基因工程等手段改造氧化葡萄糖酸杆菌，尤其是基因组改造，同源重组效率不可忽视。传统的基因工程模式菌株，如大肠杆菌，酿酒酵母，同源重组效率都很高。而氧化葡萄糖酸杆菌的同源重组效率非常低下，严重阻碍了对氧化葡萄糖酸杆菌基因组水平的改造。Red重组酶系统来源于λ噬菌体，包括Exo、Beta、Gam三种蛋白，各蛋白协同作用可指导同源重组过程。本专利技术将外源Red重组酶引入氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydansWSH-003)，得到重组菌G.oxydansWSH-003/Red，并转入同源片段进行同源重组。经验证，G.oxydansWSH-003/Red重组效率相比野生菌有了极大提高。此外，本专利技术以片段作为同源臂供体，利用外源重组酶辅助氧化葡萄糖酸杆菌同源重组改造。证明外源Red重组酶参与并有效促进了氧化葡萄糖酸杆菌的同源重组过程，并且以片段作为同源臂供体相对于质粒载体更加简化。这对氧化葡萄糖酸杆菌甚至葡萄糖酸杆菌属基因组改造都均有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个问题是提供一种同源重组效率提高的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌，是表达了外源Red重组酶。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述Red重组酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，将携带编码Red重组酶的重组载体pKD46转入氧化葡萄糖酸杆菌，获得所述氧化葡萄糖酸杆菌工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组载体pKD46的构建是以质粒pINT-ts为载体，通过酶切连接的方法，将来源于噬菌体的γ、β、exo三个基因置于ParaB启动子控制之下。具体参见One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.ProcNatlAcadSciUSA,2000Jun6；97(12):6640-5.DatsenkoKA,WannerBL。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种构建所述同源重组效率提高的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌的方法，是将编码Red重组酶的基因连接表达载体后转入氧化葡萄糖酸杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，是将携带编码Red重组酶的重组载体pKD46通过电转化方法导入氧化葡萄糖酸杆菌。所述电转条件：1800V电场强度，200Ω电阻和25μF电容。电转后涂布于氨苄青霉素抗性山梨醇培养基平板，通过控制培养温度(30℃)和抗性浓度(50μg/ml)筛选重组菌G.oxydansWSH-003/Red。所述山梨醇培养基(g/L)：山梨醇15，酵母粉1.0，pH4.8～5.1，琼脂20(固体培养基)，121℃灭菌15min。本专利技术要解决的第三个技术问题是提供一种应用所述同源重组效率提高的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌进行同源重组(敲除)的方法，所述方法主要包括(1)分别截取目标基因序列上游800-1000bp和下游800-1000bp作为上游同源臂和下游同源臂，(2)设计引入酶切位点的融合PCR引物，扩增并融合上下游同源臂，(3)标记基因通过酶切连接插入上下游同源臂之间，构建得到重组用的同源片段，(4)将同源片段转化氧化葡萄糖酸杆菌工程菌，利用标记基因筛选得到目标菌株。在本专利技术的一种实施方式中，所述标记基因包括卡那基因(kana)和胞嘧啶脱氨酶基因(codBA)，分别来自质粒pBBRMCS-2和大肠杆菌(E.coliK12)基因组。目前用于氧化葡萄糖酸杆菌大规模基因同源重组的手段极其有限，本专利技术提供的提高氧化葡萄糖酸杆菌同源重组效率的方法，将为利用同源重组进行多基因敲除或整合提供有效途径。此外，现有氧化葡萄糖酸杆菌同源重组主要是基于载体利用野生菌本身的重组系统进行同源重组，本专利技术通过外源引入同源重组酶并采用同源片段进行同源重组，简化了质粒构建过程，有效提高了同源重组效率。附图说明图1为同源片段构建过程具体实施方式实施例1质粒pKD46导入G.oxydansWSH-003通过电转化将pKD46导入G.oxydansWSH-003。具体过程分三步：1.电转感受态制备：1)取G.oxydansWSH-003甘油管在山梨醇平板上划线，30℃培养24-48h至可辨别单菌落；2)挑取一个单菌落接入装有25ml山梨醇液体培养基的250ml三角瓶中，30℃、220rpm预培养24-36h，至OD600>2；3)取2.5ml预培养的菌液接入装有25ml山梨醇培养基的250ml三角瓶中，30℃、220rpm培养6-8h后测OD600，至OD600到1.6-1.8；4)4℃下5000rpm离心5min，去上清；5)将菌体置于冰上，加20ml预冷却至0℃的10％甘油溶液重悬菌体，使菌体充分扩散；6)4℃，5000rpm离心5min，去上清；7)重复步骤5)和6)；8)将菌体置于冰上，加0.5ml预冷的10％甘油溶液，轻微混匀；9)按每管100μl进行分装至1.5ml离心管，保持冰浴状态。分装后以-80℃保存。2.转化pKD461)在冰上预冷纯化后的质粒pKD46和0.1cm电转化杯，同样将感受态置入冰中融化；2)把5μl质粒pKD46(质粒浓度50-100ng/μl)加入细胞并用微量移液器进行轻柔混合(避免引入气泡)，冰浴30min；3)将该混合物加入预冷的电转杯中(放入之前应将电转杯外壁水珠擦拭干净)；4)按照Bio-Rad电转仪的说明进行电转化，1800V电场强度，200Ω电阻和25μF电容；5)电激结束，立即加入400μl预冷的山梨醇液体培养基；6)将混合物转入14ml指形管中，充分混匀，30℃摇床好氧培养2-3h；7)取200μl培养液涂布于山梨醇培养基氨苄抗性(50μg/ml)平板，28℃倒置培养，48h可出现可辨转化子。3.G.oxydansWSH-003/pKD46菌落PCR验证实施例2同源片段构建以氧化葡萄糖酸杆菌膜葡萄糖酸脱氢酶基因的敲除为例。1)筛选标记的构建设计引物扩增来源于质粒PBBRMCS-2的卡那抗性基因(kana，序列见SEQIDNO.2)，包括开放阅读框和终止子。设计引物扩增来源于大肠杆菌基因组的胞嘧啶脱氨酶基因(codBA，序列见SEQIDNO.3)，包括开放阅读框和终止子。设计引物扩增来源于G.oxydansWSH-003基因组的tufB启动子(序列见SEQIDNO.4)。分别将卡那和胞嘧啶脱氨酶开放阅读框以融合PCR的方式连接启动子构成两个完整的标记基因，酶切连接两个标记基因，并将两个标记基因一起连接pMD19(Simple)(购自宝生物工程有限公司)，构建质粒均以大肠杆菌(E.coliJM109)为宿主按标准转化过程进行扩增。2)同源臂构建利用同源重组原理敲除氧化葡萄糖酸杆菌膜葡萄糖酸脱氢酶(membrane-boundD-gluconate2-dehydrogenase，MGDH)，需构建含该酶基因(mgdh)上下游的同源臂(序列见SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同源重组效率提高的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌，其特征在于，表达了外源Red重组酶。

【技术特征摘要】
1.一种同源重组效率提高的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)工程菌，其特征在于，表达了外源Red重组酶；编码所述Red重组酶的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；将携带编码Red重组酶的重组载体pKD46转入氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)WSH-003，获得所述氧化葡萄糖酸杆菌工程菌。2.一种构建权利要求1所述氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)工程菌的方法，其特征在于，是将携带编码Red重组酶的重组载体通过电转化方法导入氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)WSH-003。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述电转采用1800V电场强度，200Ω电阻和25μF电容，电转后涂布于氨苄青霉素抗性山梨醇培养基平板，筛选重组菌。4.一种应用权利要求1所述氧化...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，王盼盼，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32