一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的方法。其特征在于：首先在体外通过两步PCR制备得到带突变的单链核苷酸并用DNase I酶切，回收80‑100nt片段构成目标蛋白质的单链核苷酸突变库；以此单链突变库转化大肠杆菌，通过λ‑Red同源重组技术建立含有目标蛋白质突变体的大肠杆菌菌群；再次将上述单链突变库转化含有目标蛋白质突变体的大肠杆菌菌群，形成更大库容量的大肠杆菌菌群；再次转化大肠杆菌的操作循环2‑6次，构建含有目标基因突变的大肠杆菌突变库；最后通过高效筛选或高通量筛选获得目标蛋白质突变体。这一技术可应用于微生物基因原位进化，提高酶催化活性，并应用于提高微生物代谢产物的产率。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及。其特征在于：首先在体外通过两步PCR制备得到带突变的单链核苷酸并用DNase I酶切，回收80?100nt片段构成目标蛋白质的单链核苷酸突变库；以此单链突变库转化大肠杆菌，通过λ?Red同源重组技术建立含有目标蛋白质突变体的大肠杆菌菌群；再次将上述单链突变库转化含有目标蛋白质突变体的大肠杆菌菌群，形成更大库容量的大肠杆菌菌群；再次转化大肠杆菌的操作循环2?6次，构建含有目标基因突变的大肠杆菌突变库；最后通过高效筛选或高通量筛选获得目标蛋白质突变体。这一技术可应用于微生物基因原位进化，提高酶催化活性，并应用于提高微生物代谢产物的产率。【专利说明】 专利
本专利技术涉及，属于生物技术 领域。
技术介绍
定向进化技术是一种在实验室中模拟达尔文进化，进化出在自然界并不存在的或 是具有更优性质的蛋白质，并可以通过改变酶的催化效率改变代谢流，扩展或构建新的代 谢途径，弱化或消除不必要或有害的代谢途径，从而达到提高某种代谢产物产率或降解有 害物质的目的。定向进化技术主要有两个步骤:首先利用现代分子生物学方法构建基因的 突变文库，然后耦合筛选方法对文库进行筛选。突变文库的构建可以提供足够的多样性以 供筛选，是定向进化的关键步骤。按照DNA突变发生的场所，构建突变文库的技术可以分为 体外突变和体内突变。 体外突变手段通过易错PCR、饱和点突变或DNA重排等标准实验技术在感兴趣的基 因上引入多样性。体外突变手段可以有效得控制突变率和突变谱，而体内突变手段可以耦 合突变和筛选，并且可以绕开转化效率瓶颈，避免费时费力的建库，克隆，操作步骤。 最常用的体内突变手段包括化学诱变剂，碱基类似物，紫外线和超突变菌株。化学 诱变剂产生的突变谱很窄，而且可能对人有致癌作用。紫外线辐射产生的突变谱很广，而且 几乎没有序列偏好性。然而紫外线对细胞的杀伤作用限制了它的作用。最广泛应用的体内 突变方法是使用超突变菌株比如XLl-Red。此菌株通过删除和修饰DNA复制和修复相关基因 来提高突变概率，然而其突变频率无法控制，基因不稳定，生长缓慢使得分离突变子较为困 难。 George Church实验室专利技术了MAGE(多重自动基因组改造技术）。它同时针对基因 组的不同区域设计一系列的单链寡核苷酸，利用A-Red同源重组系统将这些寡核苷酸整合 到基因组上，实现单个细胞基因组多个位点的改造或细胞群体间基因组改造的多样性。利 用该技术定向改造大肠杆菌中番茄红素合成过程中的20个基因的RBS区域，设计不同的简 并引物，使它们定向进化到认为可以提高表达量的经典的SD序列(TAAGGAGGT)，最终筛选得 到高产菌株。MAGE技术利用体外合成的90nt单链寡核苷酸达到高效同源重组的目的，且针 对的改造目标都是调苄基因，并没有实现对蛋白质的结构基因进行定向进化。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质 的新方法。为此，本专利技术采用以下技术方案： 构建一个80-100nt的单链核苷酸目标基因突变库，通过A-Red同源重组技术，利用 所述突变库对大肠杆菌基因组上的蛋白质基因进行原位迭代重组，构建较大库容量的含有 目标基因突变的大肠杆菌突变库，以较高的突变率达到进化酶分子结构提高酶催化效率的 目的。 进一步地，所述方法为在体外构建目标蛋白质基因的TA克隆载体，以此载体为模 板，用error-prone PCR制备得到带碱基突变的双链核苷酸；以此双链为模板，单引物PCR制 备得到带突变的单链核苷酸；用DNase I把以上单链酶切并回收80-100nt片段构成目标蛋 白质的单链核苷酸目标基因突变库。 进一步地，所述迭代的步骤为：以得到的单链核苷酸目标基因突变库转化大肠杆菌，通过A-Red同源重组技术建 立含有目标蛋白质突变体的大肠杆菌菌群，得到初始的含有目标基因突变的大肠杆菌突变 库； 将上述单链核苷酸目标基因突变库转化初始的含有目标基因突变的大肠杆菌突 变库，得到新的含有目标基因突变的大肠杆菌突变库，形成更大库容量的大肠杆菌菌群，构 建成含有目标基因突变的大肠杆菌突变库;或者： 再用上述单链核苷酸目标基因突变库转化新形成的含有目标基因突变的大肠杆 菌突变库，得到更新后的含有目标基因突变的大肠杆菌突变库，以此不断增加含有目标基 因突变的大肠杆菌突变库的库容量，构建含有目标基因突变的大肠杆菌突变库。 单链核苷酸的获取方式包括但不限于T7逆转录法，核酸外切酶法，变性高效液相 色谱法，磁珠捕获法，不对称PCR，两步PCR法等。 80-100nt的单链核苷酸是通过降解长单链核苷酸的方式得到，它的获取方式包括 但不限于DNase頂每切，超声波破碎法等。 单链核苷酸可以通过转化或转染的方式进入细胞内。转化或转染的方式包括但不 限于磷酸钙法，氯化钙法，脂质体转染，电穿孔法，光穿孔法等。转化介质包括但不限于水， 氯化妈，脂质体等。在转化或转染之前，大肠杆菌细胞在30°C培养至一定浓度，并于42 °C进行诱导。在 细胞基因组上的A-Red同源重组系统在pL启动子控制下，并受到cI857阻遏蛋白的调控。在 30°C时pL启动子受阻遏不表达，42°C时诱导表达A-Red同源重组所需的三个蛋白。经过 15min诱导之后的细胞放于4°C保存，防止诱导的蛋白降解。 培养基需要置换成转化介质，去除其中的离子。此过程可以采用的方式包括但不 限于离心法，膜过滤法等。 本专利技术为了在大肠杆菌基因组上实现较高的突变率并对一个或多个蛋白质基因 进行突变，通过迭代A-Red同源重组的策略，达到对蛋白质进化的目的。此方法可以对基因 组上单一基因进行进化，也可以同时对多个基因进行修饰，并耦合筛选，寻找出多个突变蛋 白协同作用所达到的最佳效果。 本专利技术所提供的利用迭代同源重组进化目标蛋白质的新方法是有效获得所需蛋 白质突变的方法，比以往的方法更加简便、高效。 本专利技术所提供的，通过突变 大肠杆菌基因组上1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因，提高大肠杆菌产番茄红素 的水平。通过筛选得到5个1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶的突变体，其基因序列选自序列 表第SEQ ID勵.5、^).7、勵.9、^).11、^).13序列中的一种，分别提高了相应大肠杆菌合成 番茄红素水平50 % -300 %。 本专利技术所提供的，通过突变 大肠杆菌基因组上0s因子(Rpos)基因，提高大肠杆菌产番茄红素的水平。通过筛选得到2个 0s因子突变体，其序列选自序列表第SEQ ID NO. 19、N0.21序列中的一种，分别提高了相应 大肠杆菌合成番茄红素水平80 %和205 %。【附图说明】 图1:本专利技术流程示意图。其中，Gene:基因；Error-Prone PCR:易错PCR;Single Primer PCR:单链PCR;DNase I Digestion:DNase I酶切；cycles of Recombination:多次 重组;Genome:基因组;E ? co 1 i :大肠杆菌。图2:野生型及含DXS突变体的大肠杆菌菌株产番茄红素能力对比图；其中， Lycopene Production:番前红素产量。图3:野生型及含Rpos突变体的大肠本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用迭代同源重组体内进化目标蛋白质的新方法，其特征在于它包括以下步骤：构建一个80‑100nt的单链核苷酸目标基因突变库，通过λ‑Red同源重组技术，利用所述突变库对大肠杆菌基因组上的蛋白质基因进行原位迭代重组，构建含有目标基因突变的大肠杆菌突变库，达到进化酶分子结构提高酶催化效率的目的。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐志南，濮悦，黄磊，杭宝建，董昌，蔡瑾，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33