一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法技术

本发明专利技术涉及运用Red重组系统对目的菌株的相关基因进行敲除，获得新的突变体。具体为涉及以布洛芬降解克隆菌株3G7的Tn5转座子插入突变株3G7-G9和3G7-H5（该2株突变体中的Tn5插入位点在邻苯二酚2,3-双加氧酶基因内）为出发菌株，借助pKD46质粒的λ-red同源重组酶，将转座子Tn5从福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7电击转化至另一克隆菌株4F6，敲除4F6菌株中的邻苯二酚2,3-双加氧酶基因，获得新的转座子突变体4F6-G9和4F6-H5。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种敲除布洛芬福斯质粒邻苯二酚双加氧酶基因的方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：（1）以福斯质粒文库阳性克隆菌株3G7为出发菌株，构建其Tn5转座子插入突变株3G7?G9和3G7?H5；（2）使用布洛芬邻苯二酚2,3?双加氧酶基因（Ipf?C23O）正反向引物PCR扩增存在于Tn5转座子插入突变株3G7?G9和3G7?H5中的Ipf?C23O基因来对步骤（1）所得Tn5转座子插入突变株3G7?G9和3G7?H5进行Tn5插入片段的检测，以确认突变体中该转座子的存在；（3）以福斯质粒文库克隆菌株4F6为备选菌株，制备福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞；（4）将λ?red同源重组酶质粒pKD46高压电击转化至上述步骤（3）得到的福斯质粒克隆菌株4F6的感受态细胞中，于添加氯霉素和氨苄青霉素的LB双抗平板筛选到阳性转化子4F6?pKD46菌株；（5）以步骤（1）所得Tn5转座子插入突变株3G7?G9和3G7?H5为模板,使用ipf23O?F和R引物分别PCR扩增出突变体G9和H5中的线性DNA；制备步骤（4）所得到的阳性转化子4F6?pKD46菌株的感受态细胞，将所得线性DNA高压电击转化至感受态受体细胞4F6?pKD46菌株中，于添加氯霉素和四环素的LB双抗平板筛选新的阳性转化子4F6?G9和4F6?H5菌株；（6）消除步骤（5）所得的阳性转化子4F6?G9和4F6?H5菌株中的重组质粒pKD46；使用ipf23O?F和R引物，通过菌落PCR再次确认4F6?G9和4F6?H5突变体；（7）对步骤（1）和步骤（6）所得的Tn5转座子插入突变株3G7?G9、 3G7?H5、4F6?G9和4F6?H5以及步骤（1）中的原始出发菌株3G7和4F6进行间位苯环裂解活性（MC）测定。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卫亚红，安东尼海，程珂珂，曲东，马晓慧，李震，安卫星，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
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