一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物载体领域，特别涉及一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法及其应用。构建方法，包括以下步骤：构建aroA基因敲除打靶片段；将pKD46质粒转入BL21(DE3)菌株，获得BL21(DE3)/pKD46菌株；将aroA基因敲除打靶片段转化至该菌株，获得BL21(DE3)ΔaroA菌株。本发明专利技术提供的一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，采用大于500bp的同源侧翼序列，利用Red同源重组技术成功的敲除BL21(DE3)菌株的aroA基因；该菌株既可用于EPSPS功能互补验证，还实现了pET系统重组外源蛋白的大量表达，达到一举两得的效果。

【技术实现步骤摘要】
一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法及其应用
本专利技术涉及生物载体领域，具体而言，涉及一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法及其应用。
技术介绍
aroA基因，因其编码产物是5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate3-phosphatesynthase,EPSPS)又被称为EPSPS基因。EPSPS是只存在于细菌、真菌、藻类、顶配位寄生虫和植物中(HerrmannandWeaver,1999；MacherouxandSchmidv,1999；Keelingetal.,1999)的莽草酸途径的关键酶，其功能是是催化PEP和莽草酸-3-磷酸(shikimate3-phosphate,S3P)合成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate3-phosphate,EPSP)。莽草酸途径(shikimatepathway)是连接碳水化合物代谢和芳香族化合物生物合成的重要生物代谢途径，该途径起始于糖酵解中间产物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)和五碳糖磷酸途径中间产物赤藓糖-4-磷酸(erythrose4-phosphate)，到合成分支酸(chorismate)结束，整个过程有7种酶参与，EPSPS是倒数第二步的酶(HerrmannandWeaver,1999)。EPSPS还是世界上使用量最大的广谱灭生性除草剂草甘膦(glyphosate)的唯一靶标酶，EPSPS和PEP的结合因草甘膦在结构上是PEP的类似物而被它竞争性的抑制，从而阻断EPSP的合成，造成分支酸合成受阻，最终导致芳香族氨基酸和芳香族化合物的生物合成代谢失调，最终造成生物体的死亡(Gruysetal.,1992；Mcdowelletal.,2004)。菌株aroA内源基因的缺失，将造成菌株自身芳香族氨基酸合成受阻，在没有外源芳香族氨基酸添加的基本培养基(如M9、M63等基本培养基)中将不能正常生长，只有将aroA内源基因缺失的菌株转化进完整的能够提供充足的具有活性的EPSPS的aroA基因，该菌株才能够在基本培养基中生长，因此，aroA基因缺失的菌株可用于EPSPS功能的互补验证(Zhouetal.,2006)。Red同源重组技术是利用噬菌体Red系统介导实现外源线性DNA核苷酸片段与细菌染色体上的目标基因进行同源重组的研究方法，外源线性DNA的两端只需含有与染色体目标基因两侧同源的约50bp的序列，便可实现将目标基因同源敲除的目的。该技术在大肠杆菌K12菌株成功应用的实例很多，但用于K12菌株以外的其他大肠杆菌菌株却鲜有报道。BL21(DE3)菌株是大肠杆菌B菌株，用几十bp的短的同源序列很难实现在该菌株内的靶基因的同源替换，因此，Red同源重组技术应用于BL21(DE3)菌株存在很大的挑战。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法及其应用，以解决上述的问题。在本专利技术的实施例中提供了一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，包括以下步骤：构建aroA基因敲除打靶片段；将pKD46质粒转入BL21(DE3)菌株，获得BL21(DE3)/pKD46菌株；将aroA基因敲除打靶片段转化进入BL21(DE3)/pKD46菌株，获得所述BL21(DE3)ΔaroA菌株。优选地，所述aroA基因敲除打靶片段包括依次连接的aroA-U基因片段、FRT基因片段和aroA-D基因片段；所述aroA-U基因片段和aroA-D基因片段的长度均大于500bp。优选地，所述FRT基因片段含有Kan抗性基因片段。优选地，所述aroA基因敲除打靶片段的构建包括以下步骤：以pKD4质粒为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增获得两端含有FRT位点的Kan抗性基因片段FRT，将该片段连入克隆载体pTG19-T，获得pJA1401质粒，其中，P1和P2引物为：P1：5’-GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’P2：5’-ATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’；以BL21(DE3)菌株为模板，P3和P4为引物进行PCR扩增获得两端含有EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位点的aroA基因上游序列aroA-U，将该片段连入克隆载体pTG19-T，获得所述pJA1402质粒，其中，P3和P4引物为：P3：5’-CCGgaattcGGCAAAGATGTGGTGGTCGC-3’P4：5’-CCGggtaccCAGGCTGGCTGTGGGGATTA-3’；以BL21(DE3)菌株为模板，P5和P6为引物PCR进行扩增获得两端含有SalⅠ和HindIII酶切位点的aroA基因下游序列aroA-D，将该片段连入克隆载体pTG19-T，构建获得pJA1403质粒，其中，P3和P4引物为：P5：5’-CCGgtcgacACGGGCAATAAATAGCCAAATC-3’P6：5’-GCGaagcttTCCATCAGGCCACTGTAGACAC-3’；用EcoRⅠ和KpnⅠ分别双酶切pJA1402和pJA1401质粒，将获得的两端含有EcoRⅠ和KpnⅠ粘性末端的aroA-U基因片段连入线性化的pJA1401质粒，得到含有aroA-U基因片段和含有Kan抗性的FRT基因片段的pJA1404质粒；用SalⅠ和HindIII分别双酶切pJA1403和pJA1404质粒，将获得两端含有SalⅠ和HindIII粘性末端的aroA-D基因片段连入线性化的pJA1404质粒，构建获得含有依次连接的aroA-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和aroA-D基因片段的pJA1405质粒；以P3和P6作为引物，pJA1405质粒为模板，PCR扩增即可获得aroA基因敲除打靶片段。本专利技术还提供了上述BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法中得到的含有依次连接的aroA-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和aroA-D基因片段的pJA1405质粒。本专利技术还提供了上述BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法中得到的含有依次连接的aroA-U基因片段、FRT(Kan)基因片段和aroA-D基因片段的得aroA基因敲除打靶片段。本专利技术还提供了上述BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法中得到的pJA1405质粒的菌株。本专利技术还提供了上述BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法中得到的BL21(DE3)ΔaroA菌株。本专利技术还提供了BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株，将pCP20质粒转化入BL21(DE3)ΔaroA菌株，得到BLA-(BL21(DE3)ΔaroA)菌株。本专利技术还提供了BL21(DE3)ΔaroA菌株在功能互补中的应用。本专利技术的实施例提供的一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，采用大于500bp的同源侧翼序列，利用Red同源重组技术成功的敲除BL21(DE3)菌株的aroA基因，为该技术在BL21(DE3)菌株基因组成功敲除目标基因提供了可行的方法。aroA基因缺失的BL21(DE3)菌株，既可以用于EPSPS的功能互补验证，同时还实现了pET系统重组外源蛋白的大量表达，达到一举两得的效果。附图说明图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：构建aroA基因敲除打靶片段；将pKD46质粒转入BL21(DE3)菌株，获得BL21(DE3)/pKD46菌株；将aroA基因敲除打靶片段转化进入BL21(DE3)/pKD46菌株，获得所述BL21(DE3)ΔaroA菌株。

【技术特征摘要】
1.一种BL21(DE3)ΔaroA菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：构建aroA基因敲除打靶片段；将pKD46质粒转入BL21(DE3)菌株，获得BL21(DE3)/pKD46菌株；将aroA基因敲除打靶片段转化进入BL21(DE3)/pKD46菌株，获得所述BL21(DE3)ΔaroA菌株；所述aroA基因敲除打靶片段包括依次连接的aroA-U基因片段、FRT基因片段和aroA-D基因片段；所述aroA-U基因片段和aroA-D基因片段的长度均大于500bp；所述FRT基因片段含有Kan抗性基因片段；所述aroA基因敲除打靶片段的构建包括以下步骤：以pKD4质粒为模板，P1和P2为引物进行PCR扩增获得两端含有FRT位点的Kan抗性基因片段FRT，将该片段连入克隆载体pTG19-T，获得pJA1401质粒，其中，P1和P2引物为：P1：5’-GTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’P2：5’-ATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’；以BL21(DE3)菌株为模板，P3和P4为引物进行PCR扩增获得两端含有EcoRⅠ和KpnⅠ酶切位点的aroA基因上游序列aroA-U，将该片段连入克隆载体pTG19-T，获得所述pJA1402质粒，其中，P3和P4引物为：P3：5’-CCGgaattcGGCAAAGATGTGGTGGTCGC-3’P4：5’-CCGggtaccCAGGCTGGCTGTGGGGATTA-3’；以BL21(DE3)菌株为模板，P5和P6为引物PCR进行扩增获得两端含有SalⅠ和HindIII酶切位点的aroA基因下游序列aroA-D，将该片段连入克隆载体pTG19-T，构建获得pJA1403质粒，其中，P5和P6引物为：P5：5’-...

【专利技术属性】
技术研发人员：巩元勇，倪万潮，郭书巧，束红梅，沙琴，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32