本发明专利技术提供一种人类乳头瘤病毒HPV-11E7蛋白的表达、纯化方法，通过设计HPV-11E7的扩增引物，并从HPV-11型全病毒质粒中有效扩增出该基因，插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中，获得重组载体，转染，收集上清与4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获取HPV-11E7蛋白，行多点免疫，获得纯化的多克隆抗体。本发明专利技术增加了该蛋白原核表达时的可溶性，从而降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度，在提高表达量的同时也有利于分离纯化，使该蛋白在工业化放大生产时降低难度，减少成本，并经纯化、免疫，得到高特异性、高效价比的多克隆抗体，能提高检测的准确率，为进一步研究治疗尖锐湿疣疾病奠定基础。
【技术实现步骤摘要】
人乳头瘤病毒11E7蛋白表达及应用
本专利技术属生物
，涉及病毒蛋白的诱导表达和抗体制备，具体涉及抑制人 乳头瘤病毒11型E7蛋白原核表达及在制备多克隆抗体中的应用。
技术介绍
尖锐湿疣是一种危害我国人民健康和家庭幸福的性传播疾病，由人乳头瘤病毒 (Human Papillomavirus, HPV)引起。HPV不仅可引起皮肤粘膜上皮的抚状增生，还与多 种鳞状细胞癌的发生发展有关，亚洲地区尖锐湿疣的病原体主要为人乳头瘤病毒6b不型 (Human Papillomavirus type 6b, HPV-6b)和 11 型（Human Papillomavirus type 11, HPV-11)。HPV-11E7蛋白的表达成功可为疫苗的研制提供技术支持，也可作为感染干预性研 究提供理论方法。目前临床上缺乏可靠的检测方法，HPV-11E7蛋白抗体的专利技术可为HPV临 床检测提供新的方法，同时为科学研究提供新的方法学基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人类乳头瘤病毒HPV-11E7蛋白的表达、纯化方法，通过 以下步骤实现： (l>7/V-77^7基因的调取及扩增：设计故V-77^7的扩增引物，并从HPV-11型全病毒质 粒中有效扩增出这个基因。 其中用于扩增用于原核表达的故1-77万7序列的上游引物序列SEQ ID NO. 1 : 5' -GAATTCCCCATGGAAGACTTGTTACCC _3'，划线部分为feoR I酶切位点，下游引物序列SEQ ID NO. 2 :5^ CCGCTCGAGCGGTTCATGGTTTTGG TGCGCAGATGG -3'，划线部分为 I 酶切位点； 用于扩增用于真核表达的故V-77^7序列的上游引物序列SEQ ID NO. 3 :5' -GAATTCTA TGCATGGAAGACTTGTTACCC -3'，划线部分为feoR I酶切位点，下游引物序列SEQ ID NO. 4 : 5' -GGATCCTTATGGTTTTGGTGCGCAGATG -3'，划线部分为沒ag?H I 酶切位点； (2)///V-77i?7基因原核及真核表达载体的构建：将步骤（1)中得到的这两个两个含不 同酶切位点的/V-77^7基像序列按照先后顺序插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-Cl中，获得 用于实验的重组载体 pGEX-4T2-(HPV-llE7)和 pEGFP-Cl-(HPV-llE7)。 (3)GST-(HPV-11E7)融合蛋白的原核表达：将步骤（2)中构建的重组载体 pGEX-4T2-(HPV-llE7)转入大肠埃希菌JM109,待细菌0D值介于0. 6-0. 8之间，加 IPTG至 终浓度为〇. 2mM，并在26-28°C的诱导温度下，诱导4-6h后收集细菌。在250-300W超声功 率下，超声时间9秒，间歇时间9秒，总时长约3分钟以破碎细菌，收集上清。 (4 ) GST- (HPV-11E7)融合蛋白的纯化及HPV-11E7蛋白的获得：通过（3 )步骤 获得的上清与Glutathione-Sepharose 4B磁珠 （GE healthcare)结合，再用凝血酶（GE healthcare)切除GST标签，获取HPV-11E7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV-11E7蛋白。 本专利技术的另一个目的是提供人类乳头瘤病毒HPV-11E7蛋白在制备多克隆抗体中 的应用。本专利技术获得的人类乳头瘤病毒HPV-11E7蛋白，通过免疫动物获得血清并经过纯化 获得高特异性、高效价比的多克隆抗体，为进一步研究治疗尖锐湿疣奠定基础。 利用本领域周知的方法可以完成同源重组载体的构建，在引物的两端引入酶切位 点，通过酶切产生粘性末端，可克隆到所需载体。所用标准的分子克隆过程见（J.萨姆布鲁 克等，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2008.)。 大肠埃希菌DH5 α购于大连宝生物TaKaRa公司，pGEX-4T2原核表达载体购于GE healthcare，HPV-11型全基因质粒购于美国模式培养物集存库（American type culture collection, ATCC)，293T细胞购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。 转化重组质粒至宿主细菌中可用通常的方法，如电穿孔、制备感受态细胞等。成功 转化的细胞可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细菌经收集并裂解，提取质粒，然后PCR鉴 定、酶切鉴定或测序鉴定。 体外获得HPV-11E7蛋白，是通过基因工程手段先在大肠埃希菌中进行原核表达 GST-HPV-11E7融合蛋白，经过纯化，并切除GST标签蛋白，最终得到HPV-11E7蛋白。该蛋白 在尖锐湿疣发病机制研究中极具前景，是HPV诊断试剂开发和疫苗研发的基础。 病毒蛋白一般具有不同程度的毒性，原核表达极容易形成不溶性的包涵体，申请 人前期在大量的实验条件下，摸索可溶性蛋白的表达方式。后采用引入GST标签，并降低 IPTG浓度，降低诱导时的温度，缩短诱导时间等措施。增加了该蛋白原核表达时的可溶性， 从而降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度，在提高表达量的同时也有利于分离纯 化，使该蛋白在工业化放大生产时降低难度，减少成本。为进一步研究治疗尖锐湿疣奠定基 础。 HPV 11型是引起尖锐湿疣的主要原因之一，目前的检测手段很有限，如PCR，容易 造成假阳性，或假阴性。HPV-11抗体的专利技术可通过免疫组化，免疫荧光，酶联免疫吸附反应 等技术来检测HPV 11型病毒的感染，并且可与PCR技术联用，来检测HPV 11型的感染，能大 大提高检测的准确率。 【附图说明】 图1为重组质粒pGEX-4T2-(HPV-llE7)的电泳示意图，其中泳道Ml :TaKaRa DL 15, 000 DNA marker，泳道1 : HPV-11E7基因(用PCR法从HPV-11型全基因质粒中扩增得到)， 泳道 2 :重组 pMD-18T-HPV-llE7 质粒，泳道 3 :重组 pMD-18T-HPV-llE7 经feoR I 和斯^ I 酶切，泳道4 : pGEX-4T2质粒，泳道5 : pGEX-4T2质粒经feoR I和舱（I酶切，泳道6 :重 组 PGEX-4T2-HPV-11E7,泳道 7 :重组 pGEX-4T2-HPV-llE7 经feoR I 和斯^ I 酶切，泳道 M2 :TaKaRa DL 2, 000 DNA marker。 图2为重组质粒pEGFP-Cl-(HPV-llE7)的电泳示意图；其中泳道Ml :TaKaRa DL 15,000 DNA marker，泳道1 : HPV-11E7基因（用PCR法从HPV-11型全基因质粒中扩增得 至丨J),泳道 2:重组 pMD-18T-HPV-llE7 质粒，泳道 3:重组 pMD-18T-HPV-llE7 经feoR I 和 I酶切，泳道4 : pEGFP-Cl质粒，泳道5 : pEGFP-Cl质粒经feoR I和办洲I酶切，泳 道6 :重组pEGFP-Cl-(HPV-llE7)，泳道7 :重组pEGFP-Cl-(HPV本文档来自技高网...
【技术保护点】
人乳头瘤病毒11E7蛋白表达纯化方法，通过以下步骤实现：（1）HPV‑11E7基因的调取及扩增：设计HPV‑11E7的扩增引物，并从HPV‑11型全病毒质粒中有效扩增出这个基因，其中用于扩增用于原核表达的HPV‑11E7序列的上游引物序列SEQ ID NO.1：5’‑GAATTCCCCATGGAAGACTTGTTACCC ‑3’，划线部分为EcoRⅠ酶切位点，下游引物序列SEQ ID NO.2：5’‑ CCGCTCGAGCGGTTCATGGTTTTGG TGCGCAGATGG ‑3’，划线部分为NotⅠ酶切位点；用于扩增用于真核表达的HPV‑11E7序列的上游引物序列SEQ ID NO.3：5’‑GAATTCTATGCATGGAAGACTTGTTACCC ‑3’， 划线部分为EcoRⅠ酶切位点，下游引物序列SEQ ID NO.4：5’‑GGATCCTTATGGTTTTGGTGCGCAGATG ‑3’，划线部分为BamHⅠ酶切位点；（2）HPV‑11E7基因原核及真核表达载体的构建：将步骤（1）中得到的这两个两个含不同酶切位点的HPV‑11E7基因序列按照先后顺序插入到载体pGEX‑4T2和pEGFP‑C1中，获得用于实验的重组载体pGEX‑4T2‑(HPV‑11E7)和pEGFP‑C1‑(HPV‑11E7)；（3）GST‑(HPV‑11E7)融合蛋白的原核表达：将步骤（2）中构建的重组载体pGEX‑4T2‑(HPV‑11E7)转入大肠埃希菌JM109，待细菌OD值介于0.6‑0.8之间，加IPTG至终浓度为0.2mM，并在26‑28℃的诱导温度下，诱导4‑6h后收集细菌；在250‑300W超声功率下，超声时间9秒，间歇时间9秒，总时长约3分钟以破碎细菌，收集上清；（4）GST‑(HPV‑11E7)融合蛋白的纯化及HPV‑11E7蛋白的获得：通过（3）步骤获得的上清与Glutathione‑Sepharose 4B磁珠（GE healthcare）结合，再用凝血酶（GE healthcare）切除GST标签，获取HPV‑11E7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV‑11E7蛋白。...
【技术特征摘要】
1. 人乳头瘤病毒11E7蛋白表达纯化方法，通过以下步骤实现： (1) 故V-77^7基因的调取及扩增：设计故V-77^7的扩增引物，并从HPV-11型全病毒 质粒中有效扩增出这个基因，其中用于扩增用于原核表达的序列的上游引物序 列 SEQ ID NO. 1 :5' -GAATTCCCCATGGAAGACTTGTTACCC _3'，划线部分为 feoR I 酶切位点，下 游引物序列 SEQ ID NO. 2 :5' - CCGCTCGAGCGGTTCATGGTTTTGG TGCGCAGATGG -3'，划线部分为 I酶切位点； 用于扩增用于真核表达的故V-77^7序列的上游引物序列SEQ ID NO. 3 :5' -GAATTCTA TGCATGGAAGACTTGTTACCC -3'，划线部分为feoR I酶切位点，下游引物序列SEQ ID NO. 4 : 5' -GGATCCTTATGGTTTTGGTGCGCAGATG -3'，划线部分为沒ag?H I 酶切位点； (2) ///V-77i?7基因原核及真核表达载体的构建：将步骤（1)中得到的这两个两个含不 同酶切位点的/V-77^7基像序列按照先后顺序插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-Cl中，获得 用于实验的重组载体 pGEX-4T2-(HPV-llE7)和 pEGFP-Cl-(HPV-llE7); (3) GST-(HPV-11E7)融合蛋白的原核表达：将步骤（2)中构建的重组载体 PGEX-4T2-(HPV-11E7)转入大肠埃希...
【专利技术属性】
技术研发人员：程浩，陈贤祯，丁杨，周强，朱可建，张行，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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