【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物，具体涉及一种以甘油为碳源从头合成染料木苷的基因工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、异黄酮是豆科植物中产生的具有生物活性的多酚次级代谢产物。除了在植物生长发育中的作用外，异黄酮还表现出各种健康促进作用，例如抗氧化活性、抗炎活性、抗肿瘤活性、神经保护活性、抗骨质疏松活性以及雌激素或抗雌激素活性。其中，染料木素是最著名和研究最多的异黄酮之一。从其抗氧化活性到对不同癌症的抗癌活性，近年来染料木素已成为许多研究的兴趣化合物。染料木苷(染料木素7-o-葡萄糖苷)是染料木素的一种糖基化衍生物，与染料木黄酮相比显示出更高的溶解度和稳定性。染料木苷可通过空肠和回肠中的β-葡萄糖苷酶以及结肠中的肠杆菌有效水解为染料木素，然后迅速被整个肠道吸收。因此，染料木苷可以通过水解成染料木素在体内发挥其生物活性。
2、这些理化性质和生物活性特征导致了将异黄酮作为药物在医疗应用和保健品中的研究。市场上可用的异黄酮主要来源于大豆提取。然而，从植物材料中提取是一种不稳定的方法，因为复杂的气候条件变化和土地资源的日益短缺都可能会影响原料的可用性。同时，异黄酮本身的复杂性限制了这些化合物的化学合成。因此，选择对生态友好且不需要耕地的染料木苷生产方法是有意义的。最近，通过代谢工程将异黄酮生物合成途径在微生物表达来开发微生物细胞工厂，已成为大规模生产这些异黄酮的可持续和生态友好的替代方法。
3、异黄酮通过黄酮类分支途径生物合成，这是一般苯丙类代谢的一部分。异黄酮的结构特征是碳骨架c6-c3-c6，与其他黄酮不同的是，b环连
4、大肠杆菌是现代生物技术研究最透彻的菌株，已成为微生物生产天然产品的一种有前景的宿主生物。最近，通过应用各种菌株改良策略，大肠杆菌细胞工厂实现了最高的中间柚皮素产量(1073.8mg/l)。然而，与酵母相比，大肠杆菌没有细胞色素p450还原酶(cpr)，也没有内质网，这阻碍了ifs的表达。几个小组通过在大肠杆菌中引入关键酶，成功地将添加的前体(包括柚皮素和对香豆酸)转化为异黄酮。在之前的一项研究中，leonard和他的同事通过模仿自给自足的细菌p450的结构，率先在大肠杆菌中组装了植物p450。这种嵌合体催化的体内特异性产量比真核宿主中表达的天然酶高20倍，比植物高10倍。然而，这些异黄酮途径在大肠杆菌中的有效操作需要在培养基中补充可溶性较低且昂贵的前体，这在商业上是不利的。因此，构建一种能够从简单的碳源生产染料木苷的微生物菌株需要进一步研究。然而尽管已经实现了柚皮素的高生产率，但由大肠杆菌进行的从头染料木苷生物合成目前还存在如下几个问题：(1)通常用于柚皮素生产的葡萄糖碳源导致异黄酮产量的大幅减少，(2)染料木素引起的异黄酮合成酶的产物抑制以及(3)染料木苷对大肠杆菌宿主有毒性。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，即针对目前微生物法从头合成染料木苷的局限性，提供一种利用可再生的廉价碳源甘油从头合成染料木苷基因工程菌。
2、本专利技术还要解决的技术问题是提供上述从头合成染料木苷基因工程菌的构建方法。
3、本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述从头合成染料木苷基因工程菌的代谢工程调控方法。
4、本专利技术的思路为：针对通常用于柚皮素生产的葡萄糖碳源导致异黄酮产量的大幅减少的问题，在大肠杆菌中设计并构建了利用廉价可再生的甘油碳源从头合成染料木素的生物合成途径。该途径包括从甘油到l-酪氨酸途径、l-酪氨酸到柚皮素途径以及柚皮素到染料木素途径；针对染料木素引起的异黄酮合成酶的产物抑制的问题，我们上述染料木素合成工程菌中设计并构建染料木素糖基化途径，并表达前体udp-葡萄糖再生途径；针对染料木苷对大肠杆菌宿主有毒性，我们在上述染料木苷生产菌株中筛选和表达糖苷特异性转运蛋白；在构建了染料木苷从头合成菌株的基础上，我们在该菌株中通过人工蛋白框架缩短异黄酮合成酶和p450还原酶空间距离并提供最优的化学计量学比例，然后为了优化甘油的利用效率，过表达外源甘油利用途径，为了减少副产物生成，最大化染料木苷的合成通量，采用crispr干扰介导的基因敲低调控菌株的中心碳代谢。
5、为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：
6、本专利技术提供了一种生产染料木苷的基因工程菌，以e.coli bl21(de3)为宿主，导入通过在e.coli bl21(de3)染色体lacz基因座整合3-脱氧-d-7-磷酸阿拉伯庚酮糖酸合成酶抗反馈抑制突变体基因arogfbr和预苯酸脱氢酶抗反馈抑制突变体基因tyrafbr的过表达元件，以甘油为碳源合成l-酪氨酸；导入编码l-酪氨酸到柚皮素的转化酶编码基因tctal、pc4cl、pxchs和mschi；导入编码柚皮素到染料木素的异黄酮合成酶基因tpifs和细胞色素p450还原酶基因crcpr基因；导入编码染料木素到染料木苷的转换酶编码基因糖基转移酶基因plugt15，以及编码从纤维二糖产生udp-葡萄糖的转化酶基因纤维二糖磷酸化酶编码基因cep94a、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因ugpa；；导入编码染料木苷的特异性转出蛋白基因yadh；导入异源甘油利用途径基因alrd、aldh和gark；通过crispr干扰抑制大肠杆菌底盘细胞中的fadb、poxb、fadf、pta。
7、其中，所述的3-脱氧-d-7-磷酸阿拉伯庚酮糖酸合成酶基因arog和预苯酸脱氢酶基因tyra基因来源于e.coli k12，通过定点突变对arog进行asp-146-asn突变得到arogfbr，对tyra进行met-53-ile，ala-354-v突变得到tyrafbr。所述的arogfbr的核苷酸序列为seq idno：1，tyrafbr的核苷酸序列为seq id no：2。arogfbr和tyrafbr基因表达元件整合到大肠杆菌bl21(de3)的lacz基因座。
8、所述的l-酪氨酸到柚皮素合成途径中的酪氨酸解氨酶基因tctal来自于trichosporon cutaneum，其核苷酸序列为seq id no：3，4-香豆酰-辅酶a连接酶基因pc4cl来自于petroselinum crispum，其核苷酸序列为seq id no：4，所述的查尔酮合成酶基因pxchs来自于petunia x hybrida，其核苷酸序列为seq id no：5，查尔酮异构酶msch本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种以甘油为碳源从头合成染料木苷的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，导入了编码甘油到L-酪氨酸的途径基因aroGfbr和tyrAfbr，过表达从L-酪氨酸到柚皮素的途径基因TcTAL、Pc4CL、PxCHS和MsCHI，过表达柚皮素到染料木素需要的异黄酮合成酶基因TpIFS和细胞色素P450还原酶基因CrCPR，导入编码染料木素到染料木苷的糖基转移酶基因PlUGT15，过表达纤维二糖产生UDP-葡萄糖的纤维二糖磷酸化酶编码基因cep94A、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因ugpA；导入编码染料木苷的特异性转出蛋白基因yadH；导入异源甘油利用途径基因alrd、aldH和garK。通过CRISPR干扰抑制大肠杆菌底盘细胞中的fadB、poxB、fadF、pta。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的3-脱氧-D-7-磷酸阿拉伯庚酮糖酸合成酶基因aroG和预苯酸脱氢酶基因tyrA基因来源于E.coli K12，通过定点突变对aroG进行Asp-146-Asn突变得到aroGfbr，对tyrA进行Met-53-Ile，Ala-3
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的L-酪氨酸到柚皮素合成途径中的酪氨酸解氨酶基因TcTAL来自于Trichosporon cutaneum，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3，4-香豆酰-辅酶A连接酶基因Pc4CL来自于Petroselinum crispum，其核苷酸序列为SEQID NO：4，所述的查尔酮合成酶基因PxCHS来自于Petunia X hybrida，其核苷酸序列为SEQID NO：5，查尔酮异构酶MsCHI来自于Medicago sativa，其核苷酸序列为SEQ ID NO：6。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的柚皮素到染料木苷合成途径中的异黄酮合成酶基因TpIFS来自于Trifolium pratense，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7，细胞色素P450还原酶基因CrCPR来自于Catharantus roseus，其核苷酸序列为SEQ ID NO：8，糖基转移酶基因PlUGT15来自于Pueraria lobata，其核苷酸序列为SEQ ID NO：9，纤维二糖磷酸化酶编码基因cep94A来自于Saccharophagus degradans 2-40，其核苷酸序列为SEQID NO：10、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因ugpA来自于B.bifidum，其核苷酸序列为SEQID NO：11，染料木苷的特异性转出蛋白基因yadH来自于E.coli K12，其核苷酸序列为SEQID NO：12。
5.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的甘油利用途径中的醇脱氢酶基因aldH来自于Ralstonia eutropha H16，其核苷酸序列为SEQ ID NO：13，醛脱氢酶基因alrD基因也来自于Ralstonia eutropha H16，其核苷酸序列为SEQ ID NO：14，甘油酸激酶基因garK来自于E.coli BL21(DE3)，其核苷酸序列为SEQ ID NO：15。
6.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的CRISPR干扰系统中的dCas9基因来自于Pseudomonas aeruginosa，其核苷酸序列为SEQ ID NO：16，fadB-sgRNA包含RNA骨架和特异性N20序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO：17、poxB-sgRNA核苷酸序列为SEQ IDNO：18、fadF-sgRNA核苷酸序列为SEQ ID NO：19、pta-sgRNA核苷酸序列为SEQ ID NO：20。
7.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.权利要求1-6任意一项所述的基因工程菌在以甘油为碳源从头合成染料木苷中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(c)中，所述的发酵，其发酵条件为：在摇瓶发酵条件下，以初始工程菌OD600＝0.05-0.15接种于初始pH值为7.5-8.5的培养基中，37℃条件下培养至OD600＝1-2后，加入终浓度0.1-1mM的IPTG进行诱导，25-35℃条件下发酵12-72h，获得含的...
【技术特征摘要】
1.一种以甘油为碳源从头合成染料木苷的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌bl21(de3)为宿主，导入了编码甘油到l-酪氨酸的途径基因arogfbr和tyrafbr，过表达从l-酪氨酸到柚皮素的途径基因tctal、pc4cl、pxchs和mschi，过表达柚皮素到染料木素需要的异黄酮合成酶基因tpifs和细胞色素p450还原酶基因crcpr，导入编码染料木素到染料木苷的糖基转移酶基因plugt15，过表达纤维二糖产生udp-葡萄糖的纤维二糖磷酸化酶编码基因cep94a、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因ugpa；导入编码染料木苷的特异性转出蛋白基因yadh；导入异源甘油利用途径基因alrd、aldh和gark。通过crispr干扰抑制大肠杆菌底盘细胞中的fadb、poxb、fadf、pta。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的3-脱氧-d-7-磷酸阿拉伯庚酮糖酸合成酶基因arog和预苯酸脱氢酶基因tyra基因来源于e.coli k12，通过定点突变对arog进行asp-146-asn突变得到arogfbr，对tyra进行met-53-ile，ala-354-v突变得到tyrafbr。所述的arogfbr的核苷酸序列为seq id no：1，tyafbr的核苷酸序列为seq id no：2。arogfbr和tyrafbr基因表达元件整合到大肠杆菌bl21(de3)的lacz基因座。
3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的l-酪氨酸到柚皮素合成途径中的酪氨酸解氨酶基因tctal来自于trichosporon cutaneum，其核苷酸序列为seq id no：3，4-香豆酰-辅酶a连接酶基因pc4cl来自于petroselinum crispum，其核苷酸序列为seqid no：4，所述的查尔酮合成酶基因pxchs来自于petunia x hybrida，其核苷酸序列为seqid no：5，查尔酮异构酶mschi来自于medicago sativa，其核苷酸序列为seq id no：6。
4.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的柚皮素到染料木苷合成途径中的异黄酮合成酶基因tpifs来自于trifolium pratense，其核苷酸序列为seq id no：7，细胞色素p450还原酶基因crcpr来自于catharantus roseus，其核苷酸序列为seq id no：8，糖基转移酶基因plugt15来自于puerari...
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