本发明专利技术具体涉及一株高效赭曲霉毒素A(OTA)降解菌及其降解条件优化的方法。本发明专利技术高效OTA降解菌，代号为M30011，经鉴定为米曲霉菌Aspergillus oryzae，保藏于中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.12371，保藏时间：2016年4月15日；本发明专利技术菌株经降解条件优化后，得到最优降解条件为培养温度30℃、初始pH为8.0，接种量为108个。在此条件下米曲霉M30011菌株2d内对OTA的降解率高达93％；且降解OTA的周期与优化8d相比较缩短了62.5％。该菌可应用于食品工业，饲料工业，发酵酿造中OTA的污染处理。具有对高浓度OTA耐受能力强、降解周期短、无二次污染、使用安全，对原有处理系统不会造成不良影响等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株具有高效降解赭曲霉毒素A能力的米曲霉菌株及其降解应用。
技术介绍
赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)产生的次级代谢产物。它对肾脏和肝脏造成损害，还能致畸、致癌、致突变以及破坏免疫系统。1993年，国际癌症研究机构(IARC)将其定义为2B类致癌物。由于OTA属于积累型有毒化合物，并且能够直接污染谷类、水果等农作物，人和动物通过摄入污染的动植物性食物而吸收OTA计入体内。相关研究表明OTA的主要靶器官是肝和肾，用HPLC法检测发现OTA进入小鸡体内后广泛分布于各个器官，但以肝和肾居高。此外，OTA还具有致畸、致癌、致突变及破坏免疫系统的毒性。OTA产生菌广泛分布于自然界，粮谷类、干果、葡萄及葡萄酒、啤酒、咖啡、可可、巧克力、罐头食品、食用油、橄榄、豆制品等多种农产品及食品均有可能被OTA污染。人类通过食用污染OTA的农作物或动物组织而摄入OTA，从而受到OTA的危害。鉴于OTA在食品中普遍存在且污染所造成的巨大危害，许多国家都已经限定了食品中OTA的最高含量，并出台了相关法规标准监控其在食品和饲料内的污染情况，我国也于2011年新颁布的《食品中真菌毒素限量》国家标准GB 2761-2011中，添加了关于谷物及豆类制品中OTA强制限量5μg/kg的规定。随后于2013年公布了《葡萄酒和咖啡中赭曲霉毒素A限量(征求意见稿)》。由此可见我国已经开始重视OTA对食品安全所造成的危害。我国目前尚处于OTA真菌毒素污染来源及其规律调查的初级研究阶段，所以相关的风险监控体系也还没有建立。这成为我国食品产业发展的隐患。近年来，欧盟及其他一些发达国家对我国还设置绿色贸易壁垒，不断提高食品中OTA检测标准，导致我国出口农产品因OTA等真菌毒素污染物超标而被退回的事件时有发生。越来越严峻的贸易技术壁全和食品安全问题，使得提高OTA污染的防控水平以及对清除食品中OTA方法的研究成为刻不容缓的任务。OTA易在食品中存在且化学性质稳定不易被加工和其它理化因素所影响，亟需一种实际可行的解毒方式来应对越来越严峻的食品安全形势和贸易技术壁垒。真正有效并有应用意义的脱毒方法应该达到以下几点要求：通过脱毒处理把真菌毒素灭活或破坏，使之转化成无毒的化合物；将真菌孢子和菌丝体破坏，从而使新的毒素不能形成；脱毒的同时保持食品或饲料的营养价值和物理性质，并且要经济合理。普遍采用的理化处理OTA以及生物吸附处理OTA的方式都不能实际应用于食品工业中OTA污染的脱除。而生物降解OTA的方法与理化脱毒法即生物吸附法相比，具有较高的脱毒专一性、较强的亲和性、能够将剧毒化合物转化为无毒或低毒性化合物，并且具有经济高效。不可逆、不破坏产品的营养价值，可以避免二次污染等特点，因此生物降解OTA法具有其他脱毒方法不可比拟的优势，有着广阔的应用前景。目前，生物降解OTA的研究已经取得了较好的进展，但从理论研究到实际应用还需要做大量的探索。目前关于一些生物降解OTA的菌株报道中能起到实质性脱毒效果的菌种资源依然较少，具有高效降解能力的微生物菌种依然是稀缺资源。许多研究报道中，大部分脱毒菌种存在脱毒不彻底、毒素代谢产物依然剧毒或脱毒效率不高等问题。此外，国外绝大部分降解效果较好的脱毒菌种均已申请专利保护，我国的高效降解菌种资源非常稀缺，高效降解OTA菌种筛选工作是当前生物脱毒技术重要的研究方向之一。现阶段菌种降解OTA的周期较长，效率不高。因此寻找一种高效、廉价的酶和微生物及其制剂，缩短降解OTA周期，是生物降解OTA技术能够获得广泛应用的关键点。附图说明本专利技术涉及的高效OTA降解菌的代号为M30011，经鉴定为米曲霉菌Aspergillus oryzae。保藏单位名称：中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101；保藏编号：CGMCC No.12371；保藏日期：2016年4月15日；分类命名：米曲霉Aspergillus oryzae。图1是TLC法定性检测菌株降解OTA能力的结果图2是菌株M30011降解OTA的液相色谱图。图3是菌株M30011在鉴定培养基上的形态图4是菌株M30011的电镜形态观察图5是菌株M30011的系统发育树图6是米曲霉降解OTA各因素间交互作用的响应面及等高线图。(a)温度与初始pH的交互作用，(b)初始pH与接种量的交互作用，(c)温度与接种量的交互作用具体实施方式本专利技术以下结合具体实例作进一步说明，但并不是限制本专利技术。下面结合附图对本专利技术进一步说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条，或按照试剂盒生产商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。实验试剂：赭曲霉毒素A(OTA)购自北京泰乐祺，甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)及乙酸(色谱纯)购自Merk公司，甲苯(分析纯)、乙酸乙酯(分析纯)、甲酸(分析纯)、乙醚(分析纯)及二氯甲烷(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。纵向展剂：甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝6∶3∶1.4；培养基：缺陷培养基：KH2PO40.25g；NH4NO31.0g；MgSO4·7H2O；FeSO40.001g；20琼脂；pH＝7.0；121℃，20min灭菌；L-β苯丙氨酸或香豆素1g过滤至培养基中。基础培养基：牛肉膏3g；大豆蛋白胨5g；NaCl 10g；葡萄糖6g；水1L；pH＝7。121℃，20min灭菌待用。葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、麦芽浸粉、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、酵母膏、酵母提取物、胰蛋白胨、无菌生理盐水、CA培养基(查氏琼脂培养基)、CYA培养基、MEA培养基(麦芽提取物琼脂培养基)等购自北京双旋微生物培养基制品厂。菌株的基因组18S rDNA，通用PCR引物序列为：IST1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；IST4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。实施例1：高效降解OTA米曲霉菌株筛选鉴定1.1菌株的筛选用5mL的无菌生理盐水洗涤0.5g土壤样品，振荡混匀，静置30min；取上清液1mL，倍比稀释，涂布于缺陷型固体培养基平板，30℃培养；培养一段时间后，挑取单菌落，划线纯化；将纯化的菌株在以L-β苯丙氨酸或香豆素为唯一碳源的缺陷培养基中培养三代；接种于PDA培养基内保存；之后用于降解OTA实验。由于商品化的OTA毒素十分昂贵，以OTA为唯一碳源进行筛选的成本太大，并且在大量使用后必须进行脱毒处理，以防止对环境造成污染，本研究主要采用以L-β苯丙氨酸或香豆素为唯一碳源的缺陷型固体培养基，对不同地区100余份土样中的微生物进行初步筛选；共获得80株细菌和50株霉菌。1.2菌株降解OTA实验将筛选到的霉菌制备成孢子菌悬液，浓度约为106个/ml。将灭菌的培养基分装于50mL的离心管(灭菌)中，每管加3.7mL。再向每管中添加1.2mL的10μg/mL的OTA溶液与100μL孢子菌悬液；于30℃摇床中培养8d。同时设置对照组，空白对照体系组分为3.8mL的培养基和1.2mL 10μg/mL的OTA；阳性对照体系组分为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有降解赭曲霉毒素A的真菌菌株，其特征为：米曲霉(Aspergillus oryzae)M30011菌株，菌株于2016年4月15日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC No.12371。
【技术特征摘要】
1.一种具有降解赭曲霉毒素A的真菌菌株，其特征为：米曲霉(Aspergillus oryzae)M30011菌株，菌株于2016年4月15日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCC No.12371。2.权利要求1所述菌株通过以L-β苯丙氨酸或香豆素为唯一碳源的缺陷培养基筛选。缺陷培养基配方如下：KH2PO40.25g；NH4NO31.0g；MgSO4·7H2O；FeSO40.001g；20琼脂；pH＝...
【专利技术属性】
技术研发人员：熊科，李秀婷，支慧伟，王小玲，熊苏玥，
申请(专利权)人：熊科，李秀婷，支慧伟，
类型：发明
国别省市：北京;11
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