一种适用于土曲霉的表达载体及其制备方法技术

本发明专利技术适用于生物技术领域，提供了一种适用于土曲霉的表达载体及其制备方法。所述表达载体由在pUC19的多克隆位点处插入土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的启动子和终止子而获得；其中启动子序列为SEQ ID NO.1中的第2241‑2990位，终止子序列为SEQ ID NO.1中的第3721‑4230位。本发明专利技术提供的用于基因在土曲霉中表达的载体，无需诱导，可稳定表达；解决了其他载体在土曲霉中表达能力弱的问题。

Expression vector suitable for Aspergillus niger and preparation method thereof

The invention is applicable to the technical field of biology, and provides an expression vector suitable for Aspergillus niger and a preparation method thereof. The expression vector obtained by cloning site in pUC19 insertion of pyruvate decarboxylase gene of Aspergillus terreus in the gene promoter and terminator; the promoter sequence of SEQ ID NO.1 in 2241st 2990, terminatorsequence SEQ ID NO.1 3721st 4230. The present invention provides a vector for expressing genes in Aspergillus niger, which can be stably expressed without induction, and solves the problem of weak expression of other vectors in aspergillus.

【技术实现步骤摘要】
一种适用于土曲霉的表达载体及其制备方法
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种适用于土曲霉的表达载体及其制备方法。
技术介绍
土曲霉属于散囊菌纲，散囊菌霉目，曲霉科，拉丁名为Aspergillusterreus。菌落为土黄色，具短绒毛，似细沙分布于培养基上；营养菌丝树根状，丛生密集，分叉，有隔，分生孢子梗较短；生长较快。土曲霉的这些特性便于基因在其中大量且稳定地表达。因此，土曲霉在用于基因表达的研究方面具有巨大的应用前景。然而，现有的适用于土曲霉的表达载体多为真菌通用的载体，多采用的是构巢曲霉的3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde一3-phosphatedehydrogenase，gpd)基因的启动子，而非专门针对土曲霉，这些表达载体在土曲霉中表达能力较弱；此外，这些表达载体没有一个蛋白标记，不能用作信号通路的研究。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种适用于土曲霉的表达载体及其制备方法。本专利技术是这样实现的，一种适用于土曲霉的表达载体，所述表达载体由在pUC19的多克隆位点处插入土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的启动子和终止子而获得，其中启动子序列为SEQIDNO.1中的第2241-2990位，终止子序列为SEQIDNO.1中的第3721-4230位。进一步地，所述启动子和终止子之前插入有一段红色荧光蛋白基因，所述红色荧光蛋白基因的序列为SEQIDNO.1中的第3034-3715位。进一步地，所述红色荧光蛋白基因产生的红色荧光由波长为500～560nm的绿光激发而得。进一步地，所述载体在所述启动子序列与所述红色荧光蛋白序列之间存在SalI、NruI两个酶切位点。进一步地，所述表达载体在所述启动子的序列的上游及所述终止子的序列的下游存在通用引物M13的结合位点。进一步地，所述表达载体的基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种上述所述的表达载体的制备方法，包括以下步骤：以土曲霉基因组为模板，Ppdc-F、Ppdc-R为引物进行PCR扩增，得到土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的pdc启动子序列；将所述土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的pdc启动子序列转化至JM109中，扩大培养，并提取质粒；将提取的质粒与pUC19先后通过HindIII和Sse8387I分步酶切，得到有可互补的粘性末端的pdc启动子序列和pUC19；将所述有可互补的粘性末端的pdc启动子序列和pUC19进行重组，得到含有启动子序列的重组载体；按照上述步骤，依次将启动子序列、终止子序列、红色荧光蛋白基因导入所述重组载体中，获得所述表达载体。进一步地，所述终止子序列导入所述重组载体的过程为：以土曲霉基因组为模板，Tpdc-F、Tpdc-R为引物进行PCR扩增，得到土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的pdc终止子序列；将土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的pdc终止子序列转化至JM109中，扩大培养，并提取质粒。将提取的质粒与已插入了启动子的pUC19先后通过KpnI和EcoRI分步酶切，得到有可互补的粘性末端的pdc终止子序列和酶切载体pUC19；将上一步得到的所述有可互补的粘性末端的pdc终止子和酶切载体pUC19进行重组，得到同时含有所述启动子和终止子序列的重组载体。进一步地，所述红色荧光蛋白基因导入所述重组载体的过程为：以红色荧光蛋白为模板，DsRed-F、DsRed-R为引物进行PCR扩增，得到所述红色荧光蛋白基因序列；将所述红色荧光蛋白基因序列转化至JM109中，扩大培养，并提取质粒；将提取的质粒与已插入启动子、终止子序列的pUC19先后通过SalI和Sse8387I分步酶切，得到有可互补的粘性末端的红色荧光蛋白基因序列和酶切载体pUC19；将上一步得到的红色荧光蛋白基因序列、酶切载体pUC19进行重组，得到所述表达载体。本专利技术与现有技术相比，有益效果在于：本专利技术实施例提供的适用于土曲霉的表达载体无需诱导，可稳定表达；解决了其他表达载体在土曲霉中表达能力弱的问题，且能够通过观察红色荧光来进行土曲霉中信号通路的研究。在大肠杆菌中稳定性复制和保持、便于DNA纯化分离操作的特质。附图说明图1是本专利技术实施例提供的适用于土曲霉的表达载体构建示意图；图2是本专利技术实施例1提供的表达载体的构建示意图；图3是本专利技术实施例3提供的重组的表达载体转化至土曲霉后的表达结果示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。参见图1，本专利技术实施例提供了一种适用于土曲霉的表达载体，所述表达载体由在pUC19的多克隆位点处插入土曲霉(Aspergillusterreus)基因中的丙酮酸脱羧酶基因(pyruvatedecarboxylase，pdc，GeneID:4320296)的启动子和终止子而获得，所述表达载体的基因序列如SEQIDNO.1所示，其中启动子序列为SEQIDNO.1中的第2241-2990位，终止子序列为SEQIDNO.1中的第3721-4230位。本专利技术实施例提供的适用于土曲霉的表达载体，无需诱导，可在土曲霉中稳定表达；解决了其他表达载体在土曲霉中表达能力弱的问题。本表达载体存在原核生物基因质粒的复制起始位点(原核生物基因质粒的复制起始位点为SEQIDNO.1中的第1232-1820位)，在大肠杆菌中可稳定复制、保持，便于质粒DNA的分离、纯化；存在氨苄青霉素的抗性基因(氨苄青霉素抗性基因为SEQIDNO.1中的第201-1061位)，便于挑取存在本载体的大肠杆菌。本专利技术所提供的表达载体用以插入需研究的目的基因，待其转化入土曲霉中，可表达生成融合蛋白。所述启动子和终止子之前插入有一段红色荧光蛋白基因，所述红色荧光蛋白基因的序列为SEQIDNO.1中的第3034-3715位。通过观察转化子的红色荧光，确定待研究的基因在土曲霉中的作用位置，从而研究该蛋白在土曲霉中的作用。具体地，所述红色荧光蛋白基因产生的红色荧光有波长为500～560nm的绿光激发而得。所述载体在所述启动子序列与所述红色荧光蛋白序列之间存在SalI、NruI两个酶切位点，可双酶切，以插入目的基因。所述载体在所述启动子的序列的上游及所述终止子的序列的下游存在通用引物M13的结合位点，便于重组载体构建过程中的测序验证。所述载体主要用于土曲霉中基因的功能研究，亦可用于其他丝状真菌的研究。通过SalI、NruI酶切或者反向PCR(聚合酶链式反应，PolymeraseChainReaction)的方法使载体线性化。目的基因通过相同酶切，使其带有对应的粘性末端。通过连接酶使目的基因重组到载体上，转化到大肠杆菌中，筛选后扩大培养并提取重组质粒。转化入土曲霉或者其他丝状真菌中，通过500～560nm波长的绿光激发，观察目的基因所表达的肽链在土曲霉中的位置(肽链将会产生红色荧光)，从而发现该基因表达的肽链在土曲霉中的位置，进而研究其功能。具体地，所述载体的全长为4631bp，GC含量为51.5％。所述表达载体的基因序列如下：GACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAAT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种适用于土曲霉的表达载体，其特征在于，所述表达载体由在pUC19的多克隆位点处插入土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的启动子和终止子而获得，其中启动子序列为SEQ ID NO.1中的第2241‑2990位，终止子序列为SEQ ID NO.1中的第3721‑4230位。

【技术特征摘要】
1.一种适用于土曲霉的表达载体，其特征在于，所述表达载体由在pUC19的多克隆位点处插入土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的启动子和终止子而获得，其中启动子序列为SEQIDNO.1中的第2241-2990位，终止子序列为SEQIDNO.1中的第3721-4230位。2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述启动子和终止子之前插入有一段红色荧光蛋白基因，所述红色荧光蛋白基因的序列为SEQIDNO.1中的第3034-3715位。3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述红色荧光蛋白基因产生的红色荧光由波长为500～560nm的绿光激发而得。4.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述载体在所述启动子序列与所述红色荧光蛋白序列之间存在SalI、NruI两个酶切位点。5.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体在所述启动子的序列的上游及所述终止子的序列的下游存在通用引物M13的结合位点。6.如权利要求1至5任意一项所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的基因序列如SEQIDNO.1所示。7.一种如权利要求1至6任意一项所述的表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以土曲霉基因组为模板，Ppdc-F、Ppdc-R为引物进行PCR扩增，得到土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的pdc启动子序列；将所述土曲霉基因中的丙酮酸脱羧酶基因的pdc启动子序列转化至JM109中，扩大培养，并提取质粒；将提取的质粒与pUC19先后通过HindIII和Sse8387I分步酶切，得到有可互补的粘性末...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘思远，刘刚，王娟，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44