一种用米曲霉降解β‑胡萝卜素制备烟用香料的方法技术

本发明专利技术公开了一种用米曲霉降解β‑胡萝卜素制备烟用香料的方法。所述的米曲霉菌株分类命名为：AspergillusoryzaeYNCA9804，保藏编号CCTCC NO：M 2016654。将该菌株液体种子接种到添加β‑胡萝卜素储备液的培养基中进行发酵培养，发酵产物再经过滤除渣、减压浓缩后得到所需烟用香料。该香料具有浓郁果香味，添加到卷烟中进行评吸，具有丰富卷烟香气，降低喉部刺激性，改善余味的作用。本发明专利技术所用培养基简单，菌株性状稳定、易于保存、活化和发酵。生产工艺简单、操作性、规范性及可控性强，便于实现大规模工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Pigment preparation method of tobacco flavor by Aspergillus oryzae degradation of beta carrot

The present invention discloses a kind of Aspergillus oryzae degradation of beta carotene preparation method of tobacco flavor. The classification of Aspergillus oryzae strains named AspergillusoryzaeYNCA9804, CCTCC accession number: NO:M 2016654. The strain was inoculated into liquid seed culture medium adding beta carotene reserves of liquid fermentation, fermentation and filtering slag, concentrated and then get the required tobacco flavor. The perfume has the aroma of concentrated fruit and is added to cigarette for evaluation. It has the function of rich aroma of cigarette, reducing throat irritation and improving aftertaste. The culture medium used in the invention is simple and has stable characteristics, easy preservation, activation and fermentation. The production process is simple, operational, standardized and controllable. It is easy to realize large-scale industrial production and has a good prospect of development and application.

【技术实现步骤摘要】
一种用米曲霉降解β-胡萝卜素制备烟用香料的方法
本专利技术属于卷烟香精香料制备
，具体是涉及一种利用特殊的米曲霉菌株降解β-胡萝卜素制备烟用香料的方法。
技术介绍
在烟草行业中，香精香料对卷烟产品的口味起着决定性作用。现今生产的香料、香精中约85％的产品是通过化学合成方法得到的。但是用化学法合成的香料不仅合成较困难、且大量使用会对人体健康造成影响。随着人们生活水平的提高，对烟用香料的需求趋向于天然、健康、安全、营养和多功能性。天然香精香料是高价值的精细化工产品，但由于原料有限、提取成本高，仅仅依靠从天然动、植物中提取天然香料，远远满足不了卷烟香料市场的需求。利用微生物发酵技术可以制备香料或进行香料的转化，在提高香料产品质量的同时，还能够节约能源、降低成本，因此，科技人员对于卷烟用香精香料的生物制取技术进行了不断尝试。类胡萝卜素是一大类在自然界广泛分布的四萜类化合物，类胡萝卜素降解能产生多种化合物，如色素、维生素A和芳香类物质。类胡萝卜素降解产生的致香物质包括β-紫罗兰酮、β-大马酮、和二氢猕猴桃内酯等，因具有较低的感观阈值，是许多香料的特征香味。但这些香味物质在天然材料中含量很低，且提取成本昂贵。近年来，科研工作者们开始尝试通过酶或微生物体系模拟类胡萝卜素的自然降解，以获得新型香料。例如蒿洪欣等从土壤中分离得到6株枯草芽孢杆菌用于降解类胡萝卜素，检测出具梨香味的2-庚酮。但现有技术的效果尚不理想，难以满足工业化生产的实际需要。米曲霉(Aspergillusoryzae)在自然界广泛分布，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等，但关于用米曲霉降解β-胡萝卜素制备烟用香料的研究，在现有技术中尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种以特殊的米曲霉菌株降解β-胡萝卜素制备烟用香料的方法。所得产品符合天然香料的要求，具有浓郁果香，能够与烟香形成良好的配伍。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现。除非另有说明，本专利技术中所采用的百分数均为质量百分数。本专利技术从云南省红河州陈化烟叶中分离了一株优势微生物YNCA9804作为试验菌种，对其进行了ITS序列分析，鉴定结果表明该细菌属于曲霉属，其分类命名为米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA9804，保藏号为CCTCCNo：M2016654。本专利技术所述的米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA9804菌株的形态学特征为：菌落微膨大、疏松粉状，中间淡黄绿色，边缘白色，背面乳白色；菌丝体发达，菌丝不光滑，有隔多分枝；分生孢子梗粗糙或有麻点，孢子囊呈球形或半球形，孢子链着生于小孢子梗上。本专利技术所述的米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA9804菌株的分子鉴定特征为：测序结果在GenBank中进行同源性比对，提取相似度98％以上的序列，利用MEGA6.0软件，以领域连接法构建系统发育树，YNCA9804与菌株AspergillusoryzaestrainATCC42149聚为一簇，同源性为100％，鉴定菌株YNCA9804为米曲霉(Aspergillusoryzae)。利用所述米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA9804菌株降解β-胡萝卜素制备烟用香料的方法，包括以下步骤：(1)将米曲霉菌株YNCA9804置于斜面固体培养基中保存备用；(2)β-胡萝卜素储备液的制备：称取5gβ-胡萝卜素，溶于10mL的二氯甲烷中，待β-胡萝卜素彻底溶解后加入1gTween-80进行乳化；在避光条件下，将二氯甲烷彻底挥发干，再加入100mL无菌蒸馏水混合均匀，得储备液待用；(3)降解β-胡萝卜素的产香发酵：①将保存备用的米曲霉菌株YNCA9804转接到液体种子培养基中，摇床上28℃培养24h，转速为180r/min，得米曲霉种子液；所述的液体种子培养基：NaNO32g/L，K2HPO41g/L，MgSO4.7H2O0.5g/L，KCL0.5g/L，FeSO4.7H2O0.01g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.5～6.8，装入250mL锥形瓶，100mL/瓶，121℃，25min灭菌备用；②取步骤①所得米曲霉种子液，按培养基体积比1％接入50L发酵罐中进行液体培养，同时按培养基体积比0.1％～2％加入β-胡萝卜素储备液，50L发酵罐定容30L；所述的培养基：NaNO32g/L，K2HPO41g/L，MgSO4.7H2O0.5g/L，KCL0.5g/L，FeSO4.7H2O0.01g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.5～6.8；培养控制条件：温度25～40℃，通气比0.1～10，罐压：0.03～0.08MPa，DO≥20％，搅拌速率120～400r/min，发酵时间48h～192h；(4)发酵完成后过滤除渣，将上清液减压浓缩，即得所需烟用香料。进一步的，为防止香料变质，按烟用香料重量的5％添加丙二醇。步骤(1)中所述的斜面固体培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH值6.5～6.8，121℃，25min灭菌，冷却至60℃倒平板备用。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：(1)首次以米曲霉降解β-胡萝卜素制备烟用香料，经感官评吸测定，所得香料具有丰富烟香，增加卷烟果甜香的作用。(2)经由米曲霉菌株YNCA9804降解β-胡萝卜素得到的烟用香料，具有浓郁果香味，通过GC-MS检测，结果表明香料中含有2-庚醇、2-壬酮和二氢猕猴桃内酯等致香物质成分；将该香料添加到卷烟中进行评吸，结果表明香气量较为充足，甜韵感丰富，地方性杂气、木质气减少，喉部舒适性增加，余味较为舒适，口腔收敛较强。(3)本专利技术原料来源充足；所用培养基简单，菌株性状稳定、易于保存、活化和发酵。(4)生产工艺简单、操作性、规范性及可控性强，便于实现大规模工业化生产，具有良好的开发应用前景。保藏生物材料的说明本专利技术的菌株，已于2016年11月30日，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，该中心地址：中国湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山武汉大学内，该菌株分类命名为：米曲霉(Aspergillusoryzae)YNCA9804，保藏编号CCTCCNO：M2016654。附图说明图1为实施例1所得烟用香料样品的GC-MS检测图谱。注:1:保留时间12.797min,2-庚醇；2:保留时间20.229min,2-壬酮；3:保留时间35.788min,二氢猕猴桃内酯。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例及试验数据，对本专利技术作进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不是对本专利技术技术方案的限定。实施例1(1)将保存于固体斜面的米曲霉YNCA9804菌株(CCTCCM2016654)转接到液体种子培养基中，摇床上28℃培养24h，转速为180r/min。斜面固体培养基：马铃薯(去皮)200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，pH值6.5-6.8。121℃，25min灭菌，冷却致60℃倒平板备用。液体种子培养基：NaNO32g/L，K2HPO41g/L，MgSO4.7H2O0.5g/L，KCL0.5g/L，FeSO4.7本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用米曲霉降解β‑胡萝卜素制备烟用香料的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将米曲霉菌株CCTCC：M2016654置于斜面固体培养基中保存备用；(2)β‑胡萝卜素储备液的制备：称取5gβ‑胡萝卜素，溶于10mL的二氯甲烷中，待β‑胡萝卜素彻底溶解后加入1g Tween‑80进行乳化；在避光条件下，将二氯甲烷彻底挥发干，再加入100mL无菌蒸馏水混合均匀，得储备液待用；(3)降解β‑胡萝卜素的产香发酵：①将保存备用的米曲霉菌株CCTCC：M2016654转接到液体种子培养基中，摇床上28℃培养24h，转速为180r/min，得米曲霉种子液；所述的液体种子培养基：NaNO

【技术特征摘要】
1.一种用米曲霉降解β-胡萝卜素制备烟用香料的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将米曲霉菌株CCTCC：M2016654置于斜面固体培养基中保存备用；(2)β-胡萝卜素储备液的制备：称取5gβ-胡萝卜素，溶于10mL的二氯甲烷中，待β-胡萝卜素彻底溶解后加入1gTween-80进行乳化；在避光条件下，将二氯甲烷彻底挥发干，再加入100mL无菌蒸馏水混合均匀，得储备液待用；(3)降解β-胡萝卜素的产香发酵：①将保存备用的米曲霉菌株CCTCC：M2016654转接到液体种子培养基中，摇床上28℃培养24h，转速为180r/min，得米曲霉种子液；所述的液体种子培养基：NaNO32g/L，K2HPO41g/L，MgSO4.7H2O0.5g/L，KCL0.5g/L，FeSO4.7H2O0.01g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.5～6.8，装入250mL锥形瓶，100mL/瓶，121℃，25min灭菌备用；②取步骤①所得米曲霉种子液...

【专利技术属性】
技术研发人员：段焰青，刘秀明，焦俊，张翼鹏，党立志，付磊，刘娟，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53