本发明专利技术公开了一种检测烟曲霉及黄曲霉的通用引物及实时荧光tHDA试剂盒。本发明专利技术的检测烟曲霉及黄曲霉的通用引物能够同时检测扩增出烟曲霉及黄曲霉，同时结合了实时荧光tHDA技术，较其他普通的PCR相比，能够在恒温下进行扩增，省去了变性、退火、延伸等步骤，直接模拟生物体环境进行解旋扩增，有利于简化设备，利于在基层推广。使用本发明专利技术的试剂盒，其检测限可达到104copies(拷贝)/ml，可用于临床。能够检测出临床上最常见的两种曲霉菌感染，不但为临床节省大量宝贵的抢救时间，而且成本低廉、操作方便，具有广阔的运用前景。
【技术实现步骤摘要】
-种检测黄曲霉及烟曲霉的通用引物及实时荧光tHDA试 剂盒
本专利技术属于体外诊断核酸检测领域，具体涉及一种在临床样本中检测烟曲霉和黄 曲霉感染的荧光tHDA(热稳定解旋酶依赖性恒温扩增）试剂盒。
技术介绍
近年来，随着肿瘤患者的增多、化疗药物、免疫抑制剂和广谱抗生素的广泛使用， 特别的是在恶性血液性疾病、骨髓移植中，侵袭性真菌感染的发生率明显增高，曲霉菌感染 是仅次于念珠菌感染的侵袭性真菌感染且逐年上升。有研究表明肺部曲霉菌感染的病死率 为40%，泛发性曲霉感染为病死率为90%。在反复运用氟康唑预防真菌感染的尸检病例中 曲霉已成为首要的致病囷，而在恶性血液病患者尸检中发现曲霉囷感染率商达30%。在中 国大陆的一项统计资料表明，在侵袭性曲霉感染中，烟曲霉与黄曲霉占86. 82%，成为曲霉 菌感染的主要病原菌（高露娟，余进，李若瑜.中国大陆地区曲霉病流行现状分析[J]. 中国真菌学杂志，2010, 04:247-251)。 对于侵袭性曲霉感染，早期诊断不仅能够减少病死率，而且能够减少医疗费用及 住院天数，而目前，侵袭性曲霉菌感染的诊断主要依赖于传统的实验室诊断方法，包括：直 接涂片镜检、传统的培养方法、组织病理学方法、影像学方法、血清学方法等，然而这些方 法，每种方法均存在缺乏敏感性或特异性，而不能满足临床诊疗的需要。因此，以基因组DNA 为基础的分子生物学诊断方法倍受关注，成为国内外研究者的探索热点。近来，研究人员报 道了许多应用实时定量PCR技术（Real-time PCR)检测致病性真菌的特异核酸序列的研 究，提出了实时定量PCR检测方法可以很好地用来快速准确地诊断侵袭性真菌感染。然而， 实践表明，实时定量PCR检测方法存在着一些不足之处，例如：1)须要昂贵的PCR仪，尤其 是实时荧光PCR仪造价不菲；2)多种因素影响扩增效果；3)常引起非特异性扩增，难以在 基层推广应用等，亟待更新的方法来替代。 解旋酶依赖性恒温核酸扩增（helicase dependent amplification, HDA)，其原理 是根据解旋酶在ATP存在下能够解开DNA双链，随后两条特异性引物结合于单链DNA并在 DNA聚合酶的作用下催化合成双链，并将此次合成的DNA双链作为模版依次扩增实现指数 倍的扩增。采用研究表明，HDA能很好地扩增微生物基因组DNA、质粒DNA和cDNA等。目 前根据所采用的解旋酶的不同，可以分为1、室温HDA，采用大肠杆菌解旋酶和Mutl蛋白在 常温下即可；2、热稳定 HDA (thermophilic helicase dependent amplification，tHDA)，从 嗜热杆菌中提取的热稳定解旋酶，此过程较室温HDA相比不需要Mutl蛋白及单链结合蛋白 (SSB)。本专利技术是采用tHDA作为扩增方法，在较高的温度下扩增反应可以减少非特异性扩 增，同时更有利于解旋酶进行DNA解旋（CN03824150. 1)。 作为一种崭新的核酸扩增方法，与普通PCR技术相比，该方法具有不需要经过变 性-退火-延伸的多次循环扩增，可以简化设备、降低成本更有利于在偏远地区的推广运用 的巨大优势。另外，较其他常见的恒温扩增技术也具有相应优势，如：链替换扩增（SDA)需 要4条引物来实现早期扩增，转录介导的扩增（TMA)在转录、cDNA合成以及RNA降解过程 需要三种酶来实现恒温的扩增。 实时荧光tHDA是tHDA技术与荧光定量技术的结合。仅利用tHDA扩增技术对终 产物进行定性或定量分析，无法对起始模板准确定量，而实时荧光tHDA技术利用荧光信号 的变化实时监测HDA扩增反应中每一循环扩增产物量的变化，通过Ct值及其标准曲线的分 析能够对起始模板进行定量分析。但是，目前国际上对tHDA扩增技术处于起步阶段，虽现 有利用tHDA扩增技术运用于曲霉菌的检测（王小婷.解旋酶依赖性DNA恒温扩增技术用 于黄曲霉检测的研究[D].福建医科大学，2012.)，但其敏感性较低，并且无法定量分析起 始模板，目前国内外尚未有将实时荧光tHDA技术运用于曲霉菌的检测。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术首次建立起一种快速检测曲霉菌的实时荧光tHDA技术，从 而更有利于建立简单便捷的临床和实验室诊断，也使对于基因层面的床旁检验成为可能。 本专利技术的一个目的是提供一组作为引物使用的，能够同时检测出烟曲霉及黄曲霉 的寡核苷酸序列。 本专利技术的另一个目的是提供一种既快速、准确，又易于标准化的能够检测烟曲霉 及黄曲霉的实时荧光定量tHDA试剂盒。 具体而言，一方面，本专利技术提供一组检测曲霉菌的引物，该组引物包括序 列表SEQ ID N0 :1和SEQ ID N0 :2所示的寡核苷酸序列。其中，扩增检测曲霉 菌的正向引物为：TGCATTTAATAGCAATGCACGATAC ;扩增检测曲霉菌的反向引物为： CAAAGTAAGGAGCGAAAGGTAATCTA 〇 为解决所述第二个技术问题，本专利技术采用的检测曲霉菌的实时荧光tHDA试剂盒， 保存于-20°C。包括DNA提取剂，tHDA反应液，酶混合物，dNTP，荧光染料：包括EvaGreen Dye和ROX reference Dye (其为市售染料名称，目前尚无统一中文译文）；灭菌纯水；阴性 对照：无插入有特异性片段的PUC18-T载体质粒；阳性对照：含有烟曲霉或黄曲霉DNA样 本；标准品：含有插入有曲霉的特异性片段的PUC18-T载体质粒。本专利技术将采用EvaGreen Dye作为实时荧光定量的染料，该染料与常用的荧光定量染料相比，具有良好的稳定性，对 扩增反应的抑制性也小。 所述的标准品为含有插入曲霉菌特异序列的PUC18-T载体质粒，所插入的序列如 下： GATGGCTACAGCTTTCTTAGGTTATGTTTTACCTTATGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCTACAGTTAT TACTAATCTTATGAGTGCTATACCTTGAATAGGTCAAGATATAGTTGAATTTATATGAGGTGGTTTCTCTGTAAATA ATGCTACATTAAATAGATTCTTTGCATTACATTTCTTATTACCTTTTGTTTTAGCTGCATTAGTAATAATGCATTTA ATAGCAATGCACGATACTGTAGGATCTGGTAATCCTTTAGGTATTTCTGGTAATTATGATAGATTACCTTTCGCTCC TTACTTTGTATTTAAAGATTTAGTTACTGTATTTATTTTCTTTATAGTATTATCTGTATTTGTATTCTTCATGCCTA ACGCATTAGGTGATAGTGAAAATTATGTTATGGCTAATCCAATGCAAACTCCACC 所插入的DNA序列为采用正向引物序列（GATGGCTACAGCTTTCTTAGGT)、反向引物序 列（GGTGGAGTTTGCATTGGATTAG)为扩增引物，并以烟曲霉DNA为模板进行普通PCR扩增所 得扩增产物。该扩增产物包含有以通用引物tHDA扩增的特异性DNA序列。标准品制备方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组检测烟曲霉及黄曲霉的通用引物，其特征在于，所述通用引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述反向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1. 一组检测烟曲霉及黄曲霉的通用引物，其特征在于，所述通用引物包括正向引物和 反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所示，所述反向引物的核苷酸 序列如序列表SEQ ID NO :2所示。2. -种检测曲霉菌感染的实时荧光tHDA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组 分： (1) DNA提取试剂； (2) tHDA反应液，其中包括：tHDA缓冲液、1%504、似(：1、(1阶1\引物1、引物11，其中，所述 引物I的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示，所述引物II的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :2 所示； (3) 酶混合物，其中包括：热稳定DNA解旋酶、Bst聚合酶和热稳定性单链结合蛋白ET SSB ； (4) 荧光染料； (5) 阴性对照：为无插入烟曲霉或黄曲霉的特异性片段的pUCIS-T载体质粒； (6) 阳性对照：为含有烟曲霉或黄曲霉DNA的样本；； (7) 标准品：为插入有烟曲霉或黄曲霉的特异性片段的pUCIS-T载体质粒； (8) 灭菌纯水。3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂包括：Buffer I， Buffer II, Buffer III，蛋白酶K，溶壁酶（lyticase);所述突光染料包括：EvaGreen Dye和 ROX reference Dye。4. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品中插入的特异性序列如下： GATGGCTACAGCTTTCTTAGGTTATGTTTTACCTTATGGTCAAATGAGTTTATGAGGTGCTACAGTTATTAC TAATCTTATGAGTGCTATACCTTGAATAGGTCAAGATATAGTTGAATTTATATGAGGTGGTTTCTCTGTAAATAATG CTACATTAAATAGATTCTTTGCATTACATTTCTTATTACCTTTTGTTTTAGCTGCATTAGTAATAATGCATTTAATA GCAATGCACGATACTGTAGGATCTGGTAATCCTTTAGGTATTTCTGGTAATTATGATAGATTACCTTTCGCTCCTTA CTTTGTATTTAAAGATTTAGTT...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈建箴，肖世极，吴淡森，付海英，周华蓉，黄金梅，黄劲龙，王小婷，张胜蓝，
申请(专利权)人：福建医科大学附属协和医院，
类型：发明
国别省市：福建;35
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