本发明专利技术公开了一种N端替换提高米曲霉木聚糖酶热稳定性的方法。基于高性能计算机及其相关生物学软件对Aspergillus oryzae常温木聚糖酶AoXyn11A耐热性改造的理性设计，将AoXyn11A N端41个氨基酸替换成同一家族耐热木聚糖酶TfGH11 N端42个氨基酸，获得了一种耐热杂合木聚糖酶ATX11A，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。该杂合酶基因ATx11A是采用大引物PCR技术由AoXyn11A和TfGH11基因的相应片段拼接而成的，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。将重组毕赤酵母GS115/ATx11A在30℃诱导72 h，期间每隔24 h添加1.0％(v/v)甲醇。表达的耐热杂合酶ATX11A的最适温度由AoXyn11A的50℃提高至65℃；在60℃处理1 h，ATX11A的半衰期由AoXyn11A的1.3 min延长至55 min。
【技术实现步骤摘要】
-种N端替换提高米曲霉木聚糖酶（AoXyn11 A)热稳定性的 方法
常温木聚糖酶（AoXynllA)源自米曲霉（Aspergillus oryzae)CICC 40186 菌株。 本专利技术涉及一种耐热杂合木聚糖酶的理性设计及杂合木聚糖酶基因的构建和表达的方法， 属于生物工程
。
技术介绍
内切β -1，4-D-木聚糖酶简称木聚糖酶（EC 3. 2. 1. 8)是一种重要的工业用酶。它 作用于木聚糖的主链，随机切割木聚糖内部的β -1，4糖苷键，水解产物主要为不同聚合度 的木寡糖和少量木糖，是木聚糖降解酶系中最关键的酶。近年来，由于木聚糖酶在造纸、饲 料、食品和酿造等工业领域具有潜在的应用价值，尤其是在造纸工业中的应用，可减少因化 学物质漂白产生的环境污染，受到了越来越多的关注。然而在许多应用领域中，木聚糖酶需 要在高温条件下使用，因此对木聚糖酶热稳定性研究和耐热酶制备已引起了国内外研究者 的高度重视。目前主要采用两种途径获取耐热木聚糖酶：一是从自然界中筛选产耐热酶的 菌株，二是利用基因工程技术对常温酶进行耐热性改造。 依据对酶催化域一级和空间结构的比对和疏水簇分析，绝大多数木聚糖酶归属糖 苷水解酶10和11家族。由于11家族木聚糖酶分子量较小，且结构相对简单，较适合作为理 论研究的分子模型，用于极端条件下木聚糖酶催化模式和蛋白分子折叠机理等的研究。随 着分子生物学、生物信息学及计算机科学的快速发展，为酶蛋白分子的改造开辟了新的途 径。本专利技术运用计算机及其相关生物学软件，将生物信息学分析与分子生物学操作相结合， 定向改造 AoXynllA以提高其热稳定性，拓展该木聚糖酶的应用领域。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种耐热杂合木聚糖酶的理性设计以及杂合木聚糖酶基因 的构建和表达的方法。 本专利技术的技术方案：首先借助高性能计算机及其相关生物学软件对源自A. oryzae CICC 40186的11家族常温木聚糖酶AoXynllA的耐热性改造进行理性设计；然后将 AoXynl IA N端41个氨基酸替换成同一家族耐热木聚糖酶TfGHl I (PDB: 3ZSE) N端42个氨基 酸，得到一种耐热杂合木聚糖酶，命名为ATX11A，其氨基酸序列为SEQ ID N0:1。该杂合酶 基因由AoXynl IA和TfGHl 1编码基因的相应片段拼接而成，命名为ATxl 1A，其核苷酸序列为 SEQID NO:2。 所述的AoXynllA基因 AoxynllA克隆自A. oryzae菌株（购自中国工业微生物 菌种保藏中心，编号为CICC 40186);重组克隆质粒pUCm-T-AoxynllA(已公开，GenBank accession No. JQ326257)由江南大学构建和保藏。 所述的木聚糖酶基因 xynllPM是基于耐热TfGHll催化域基因序列（GenBank accession No. AY795559)并参照毕赤酵母（Pichia pastoris)密码子偏爱性由人工合成 的；重组克隆质粒pUCm-T-xynllPM由江南大学构建和保藏。 木聚糖酶活性的测定：于25mL具塞试管A和B中各加入用pH 5.5、柠檬 酸-Na2HPO4缓冲液配制的0. 5% (w/v)桦木木聚糖溶液2. 4mL，50°C预热lOmin，在A管中 加入0. ImL适当稀释的酶液，50°C准确反应15min ;立即各加入2. 5mL DNS试剂，在B管中 补加0. ImL酶液，煮沸7min ;冷却后各加入去离子水5mL，混匀；540nm处以B管为对照测定 A管吸光度值，从木糖标准曲线上查出相应的还原糖（以木糖计）含量。在本测定条件下， 每分钟产生1 μ mol还原糖的酶量定义为1个木聚糖酶活性单位（U)。 耐热杂合木聚糖酶ATXllA的理性设计、ATxllA的构建和表达： ⑴木聚糖酶空间结构的同源建模：以常温木聚糖酶AoXynllA序列为模板，在 GenBank数据库（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genbank/)中运用 BLAST服务器进行木聚 糖酶序列搜寻和同源比对，找到了与AoXynllA序列高度同源的耐热酶TfGHll。以TfGHll 已知晶体结构（PDB:3ZSE)为模板，运用SWISS-MODEL在线程序（http://swiss_model. expasy. org/on-line)分别对AoXynllA和各种拟杂合酶进行同源建模。运用软件 Verify_3D对同源建模的各结构模型进行评估和优化。 (2)木聚糖酶空间结构的分子动力学模拟：用GR0MACS 4. 0程序包（http://www. gromacs.org/)在高温下对木聚糖酶空间结构进行分子动力学（molecular dynamics, MD) 模拟。本专利技术采用的MD模拟体系设定为：温度500K，力场GR0M0S 96,溶质分子被I. 5nm的 TIP3P水分子层包裹。在MD模拟之前，分别对受约束和去约束的溶质分子体系进行两次能 量优化，即先采用最陡下降法优化800步，再用共轭梯度法优化1200步。MD模拟分两步进 行：首先在300K对受约束溶质分子模拟IOOps ;再对去约束溶质分子模拟10ns，此阶段温 度从300K升高至500K。MD模拟结束后，将模拟得到的AoXynl IA和已知的TfGHl 1各个氨基 酸的B-factor值分别导入PDB文件中，使用B-FITTER软件导出这些值。基于两者B-factor 值大小和波动性比对，选取AoXynllA N端若干区段分别用TfGHll对应区段进行替换。对 各种拟杂合酶进行MD模拟，使用GR0MACS 4. 0的g_rms软件分别计算AoXynl 1A、TfGHll和 拟杂合酶的根均方偏差（root mean square deviation, RMSD)值。通过比较各RMSD值的 大小，最终确定的杂合木聚糖酶是将AoXynl IA N端41个氨基酸替换成TfGHl IN端42个氨 基酸，该杂合酶命名为ATXl 1A。 (3) ATXlIA编码基因 ATxlIA的构建：根据ATXlIA编码基因序列（SEQ ID NO: 2)设 计3条PCR引物： Xyl-F ：5' -GAATTCGCTGTTACCTCCAACGAGACCG-3'，含 EcoR T 酶切位点 PJ-R ： 5; -CCGACGAAGTTGCCAGTGTTTCTCCAGG-3; Xll-R ：5' -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3,，含 Not I 酶切位点 以保藏的pUCm-T-xynl IPM为模板、Xyl-F和PJ-R为引物，进行第一轮PCR扩增；再 以保藏的pUCm-T-AoxynIlA为模板、第一轮PCR产物和Xll-R为引物，进行第二轮PCR扩增 获取杂合酶编码基因 ATxllA。该PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析、割胶回收、与pUCm-T 质粒连接，获重组克隆质粒pUCm-T-ATxllA，转化E. coli JM109,转化子经蓝白斑筛选和酶 切本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐热杂合木聚糖酶ATX11A，其特征是将来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC40186的糖苷水解酶11家族常温木聚糖酶AoXyn11A N端41个氨基酸替换成同一家族耐热木聚糖酶TfGH11(PDB:3ZSE)N端42个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
【技术特征摘要】
1. 一种耐热杂合木聚糖酶ATX11A，其特征是将来源于米曲霉（Aspergillus oryzae) CICC40186的糖苷水解酶11家族常温木聚糖酶AoXynllA N端41个氨基酸替换成同一家族 耐热木聚糖酶了《^11(?〇8:323￡0端42个氨基酸，其氨基酸序列为3￡〇1〇勵:1。2. 权利1所述的ATX11A编码基因由AoXynllA和TfGHll编码基因的相应片段拼接而 成，命名为ATxllA，其核苷酸序列为SEQ ID N0:2。3. 耐热杂合木聚糖酶的理性设计：将分子动力学（MD)模拟得到的AoXynllA和已知的 TfGHll各个氨基酸的B-factor值分别导入PDB文件，用B-FITTER软件导出这些值；两种 酶B-factor值的分析表明，AoXynllA N端氨基酸的B-factor值及其变化值均较TfGHllN 端的大，表明AoXynllA的热稳定性差；因此，选取AoXynllA N端若干区段分别用TfGHll对 应的区段进行替换，获得各种拟杂合木聚糖酶;MD模拟各种拟杂合酶，用GR0MACS 4. 0程序 包中的g_rms软件分别计算AoXynllA、TfGHll和拟杂合酶的RMSD值；基于各种酶RMSD值 的分析，最终确定的杂合酶命名为ATX11A，其RMSD值明显低于AoXynl 1A或其它拟杂合酶的 RMSD 值。4. 根据ATX11A编码基因序列（SEQ ID N0:2)设计3条PCR引物： Xy...
【专利技术属性】
技术研发人员：邬敏辰，何瑶，殷欣，李剑芳，姚瑶，吴芹，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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