一种新型内切木聚糖酶及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种新型内切木聚糖酶及其编码基因和应用。本发明专利技术还涉及含有所述编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明专利技术还涉及利用所述木聚糖酶形成简单糖的方法。本发明专利技术还涉及提高所述木聚糖酶热稳定性的突变体和提高该木聚糖酶热稳定性的方法。本发明专利技术的木聚糖酶的酶活性高，具有宽的pH适用范围和良好的温度稳定性，可良好地应用于工业生产。

【技术实现步骤摘要】
一种新型内切木聚糖酶及其编码基因和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种新的内切木聚糖酶，其编码基因和应用。
技术介绍
木聚糖简介。木聚糖，由木糖分子（D Xylose)以β-1，4-糖苷键连结成主链；阿 拉伯呋喃糖苷基、葡糖醛酸基或乙酰基等连结成支链。木聚糖是植物细胞壁中半纤维素的 主要成份，半纤维素是植物多糖中仅次于纤维素的重要成份，是自然界中除纤维素为含量 最为丰富的可再生植物多糖。 木聚糖的来源。富含木聚糖的原料来源广泛，包括硬木、软木、秸杆、稻草、麸皮等 农、林、工业废弃物及城市固体垃圾等。且不同植物所含木聚糖的多少也有所差别，硬材中 所含木聚糖比软材中多，硬材中能占到干重的15?30%，软材中一般占干重的7?12%。而 在一些一年生植物如小麦、甘煎、棉子壳中，木聚糖含量则高达3〇%以上。 木聚糖酶简介。木聚糖酶是一系列能特异降解木聚糖的糖基水解酶的总 称。由于组成木聚糖单糖单元的差异、键的类型不同、以及木聚糖中存在许多不同 取代基的支链，木聚糖的彻底降解需要多种酶参与，包括：内切-1，4-β-木聚糖酶 (end〇-i3-l，4_xylanase，EC3. 2. 1. 8)，β-木糖苷酶（i3_xylosidase，EC3. 2. 1. 37)， a -L-阿拉伯呋喃糖苷酶（a -L-arabinofuranosidase，Ε· C. 3. 2. L 39)、β -D-葡萄糖醒 酸苷酶（β-D-glucuronidase，EC3.2. I. 39)、乙醜木聚糖酯酶（acetyl xylan esterases， E. C. 3. I. I. 72)以及降解阿拉伯糖侧链残基与酚酸（如阿魏酸或香豆酸）形成的酯键酚 酸酯酶（ferulic or p-coumaric acid esterase，E.C.3.2.1.73)等。其中，内切-1， 4-β_木聚糖酶是降解木聚糖最主要的酶。该酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的 β-1，4-木糖苷键，将大分子多聚木糖水解为低聚木糖和少量木糖，从而起始多聚糖的逐步 降解（Bernier R, Driguez Η, Desrochers M Gene26:59 _ 65, 1983) 木聚糖酶在传统产业中的应用。木聚糖酶被广泛应用于包括食品、饲料、造纸、纺 织等各种工业部门中，并在其中扮演重要的角色。第一，在食品工业中，木聚糖酶被用于水 果、蔬菜和植物加工，以促进浸渍过程，使汁液澄清，提高产量和过滤效率；被用于葡萄酒制 造和酿造以促进葡萄皮浸渍和降低成品的混浊度；被用于培烤、磨粉、糕点、糖果的加工中 以提高面团的弹性和强度，改善面包质地；被用于咖啡加工中，以降低咖啡提取物的粘度并 改善了干燥/冻干过程。第二，在造纸工业中，木聚糖酶被用于促进制浆处理和代替机械制 浆，不仅能有效降低能量消耗还可提高纸浆的原纤维形成和透水性进而提高加工效率和纸 张强度。第三，在纺织工业中，木聚糖酶被用于纺织品（亚麻，黄麻，兰麻，大麻等）的酶解 中，以减少或替代化学混麻方法。第四，在农牧业中，木聚糖酶被广泛应用于单胃动物（如 猪和家禽）以及反刍动物的饲料中。辅助动物有效降解木聚糖，降低饲料中非淀粉多糖的 含量，以提高饲料的可消化性和营养价值同时减少环境污染。 木聚糖酶在生物能源领域的作用。尤为重要的是，在全球化石资源日益枯竭，开发 新型生物能源迫在眉睫的背景下，木聚糖酶可与其他纤维素酶、半纤维素酶共同应用于将 木质纤维素转化为燃料乙醇的工业生产中。一方面，木聚糖酶通过降解木质纤维素中与木 质素及纤维素骨架链紧密交联的半纤维素链，大大提高纤维素酶接触并作用于纤维素链的 频率和效率，从而间接提高纤维素的降解效率；另一方面，随着近年来五碳糖发酵途径及菌 株的研究、开发，利用细菌、酵母及丝状真菌发酵木聚糖水解产物木糖生产燃料乙醇的工艺 日趋成熟。两方面共同作用使木质纤维素的转化效率大大提高，从而有效降低燃料乙醇的 生产成本。 木聚糖酶的研究历史。由于木聚糖酶有着广泛的用途，对木聚糖酶的研究早在 六十年代就已开始，且己经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型不同功能的木聚 糖酶。研究得较为清楚的有Trichoderma reesei (里氏木霉）、Aspergillus niger (黑 曲霉）、Streptomyces lividans(变铅青链霉菌）、Cellulomonas 肥杆菌）、 Clostridium thermocellum(热纤梭菌）、Penicillium simplicissimum(简青霉）等所产 生的木聚糖酶。需要指出的是，这些木聚糖酶基因大部分都是从纯培养的微生物中分离出 来的，而自然界中可培养微生物的种类尚不足1%，获得的木聚糖酶在理化特性、催化效率、 产量等方面也远远不能满足现代工业生产的需求。 鉴于现有技术中大部分木聚糖酶的活力较低，在理化特性、催化效率、产量等方面 也远远不能满足现代工业生产的需求，有必要进一步扩大筛选对象，从中筛选出新的、酶活 性高的木聚糖酶，以用于工业生产，提高生产效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型内切木聚糖酶及其编码基因和应用。 本专利技术的目的在于提供包括内切木聚糖酶基因的表达载体和宿主细胞，基因的表 达和蛋白纯化方法，以及重组蛋白的酶学特性和功能特征。 在本专利技术的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组： (a)如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽； (b)由SEQ ID NO:2的第19 - 272位氨基酸残基组成的多肽片段； (c)由SEQ ID NO:2的第19 - 267位氨基酸残基组成的多肽片段； (d)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中第19-267位氨基酸的多肽； (e)由（a)、（b)、（c)或（d)中所述的多肽经过一个或多个（如1-20个，较佳地 1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个）氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有多肽（a) 功能的多肽； (f)在（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末 端添加信号肽序列后形成的多肽。 在一个优选例中，所述的多肽来源于高等食木非培菌黄球白蚁肠道系统的元基因 组。 在一个具体实施例中，所述（a)多肽的功能包括但不限于作为内切木聚糖酶的功 能。 在一优选实施例中，（e )所述多肽除保留内切木聚糖酶功能外，还相对于野生型序 列而目还具有提1?的热稳定性。 在一个具体实施例中，所述多肽选自： (i) SEQ ID NO:2 ;和 (ii) SEQ ID NO:2的至少含有其第19-267位氨基酸的片段。 在一个具体实施例中，所述片段为由SEQ ID NO: 2的第19 一 272位氨基酸残基组 成的片段。 在一个具体实施例中，（e)所述多肽选自在SEQ ID N0:2的至少一个下述位点存 在氨基酸取代的多肽：K32、N37、S42、M80、K205、E219、A221、M222、K223、T228 和 A386。 在一个具体实施例中，（e)所述多肽至少在SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：（a）如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；（b）由SEQ ID NO:2的第19－272位氨基酸残基组成的多肽片段；（c）由SEQ ID NO:2的第19－267位氨基酸残基组成的多肽片段；（d）包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中第19‑267位氨基酸的多肽；（e）由（a）、（b）、（c）或（d）中所述的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加后仍具有多肽（a）功能的多肽；（f）在（a）、（b）、（c）、（d）或（e）所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。

【技术特征摘要】
1. 一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组： (a) 如SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽； (b) 由SEQ ID NO:2的第19 一 272位氨基酸残基组成的多肽片段； (c) 由SEQ ID NO:2的第19 一 267位氨基酸残基组成的多肽片段； (d) 包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中第19-267位氨基酸的多肽； (e) 由（a)、（b)、（c)或（d)中所述的多肽经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添 加后仍具有多肽（a)功能的多肽； (f) 在（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端 添加信号肽序列后形成的多肽。2. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自： 在对应于SEQ ID N0:2的至少一个下述位点存在氨基酸取代的多肽：K32、N37、S42、 M80、K205、E219、A221、M222、K223、T228 和 A386。3. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自： (1) 在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K32T ; (2) 在对应于SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：N37D ; (3) 在对应于SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：S42N ; (4) 在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：M80I ; (5) 在对应于SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K205E (6) 在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：E219D ; (7) 在对应于SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：A221T ; (8) 在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：M222L ; (9) 在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223M ; (10) 在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223T ; (11) 在对应于SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223C ; (12) 在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223S ; (13) 在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223G ; (14) 在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223L ; (15) 在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：T228S ; (16) 在对应于SEQ ID NO:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：A386S ; (17) 在对应于SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K205E、K223T 和 A386S ; (18) 在对应于SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K32T和K223T; (19) 在对应于SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K205E和 K223T ； (20) 在对应于SEQ ID N0:2的下述位置上发生了如下所述取代的多肽：K223E、K223T、 K223C、K223S、K223...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志华，王钱福，钱昌丽，刘宁，严兴，魏维，王倩，谢磊，黄勇平，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31