本发明专利技术涉及一种快速分析米曲霉发酵过程中主要蛋白酶的方法，步骤如下：蛋白质提取；LC‑MS/MS蛋白质定量分析。本发明专利技术方法能够快速分析米曲霉发酵过程中分泌的各类型蛋白酶，也能够分析微生物米曲霉固体和液体发酵过程中不同时期分泌的主要蛋白酶种类、比率、调节型、基因代码以及分子量，提高了分析速度，给使用带来了方便，提高了工作效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，尤其是一种快速分析米曲霉发酵过程中主要蛋白酶的方法，该方法基于ITRAQ技术，快速分析米曲霉发酵过程中主要蛋白酶。
技术介绍
米曲霉(Aspergillusoryzae)，属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，从梗孢科，曲霉属真菌的一个常见种。米曲霉可以产复合酶，如：蛋白酶、糖化酶、淀粉酶、植酸酶、纤维素酶等，不产毒素，是食品工业中一株安全的工业菌株。各种蛋白酶在发酵的过程中可以使大豆类蛋白分解为多肽和多种氨基酸。由这些复合酶分解后的原料易被人体吸收，营养价值大大提高，多种发酵食品中都用米曲霉来分解原料，酱油中也是如此。由此可见，米曲霉在酱油发酵中占有非常重要的作用。相对和绝对定量同位素标记(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技术是美国应用生物系统公司在2004年推出的一项新的体外同位素标记技术。使用该技术可以寻找差异表达蛋白，并分析其蛋白功能，同时可以对1个基因组表达的全部蛋白质或1个复杂的混合体系中的所有蛋白质进行精确定量和鉴定。如今，iTRAQ技术已经在蛋白质组学的定量研究中得到了极其广泛的应用。定量方法主要有两种。一种基于传统双向凝胶电泳及染色，另一种基于质谱检测技术。目前，应用比较广泛的双向电泳技术主要是双向荧光差异凝胶电泳，双向电泳对于低丰度蛋白、相对分子质量＞200kD的蛋白和相对分子质量＜8kD的蛋白、极碱性蛋白和疏水性蛋白都难以进行有效分离。而iTRAQ技术可以对任何类型的蛋白质进行鉴定。此外，双向凝胶电泳操作费时费力，难以实现和质谱的直接联用，不易自动化。基于质谱的蛋白质组学定量技术可以分为两大类：标记定量技术和非标记定量技术。标记定量技术可通过使用代谢标记(metaboliclabeling，15N标记)、同位素编码的亲和签(isotope-codedaffinitytags，ICAT)和在培养过程中使用稳定性同位素标记的氨基酸(stableisotopelabelingofaminoacidsinculture，SILAC)等来区别两种不同样品的蛋白质，后再通过质谱进行含量比较。iTRAQ标记相比ICAT/SILAC等主要有以下优点:第一，标记发生反应，单肽来自于自由的氨群，因此相对定量化；第二，作为标记的反应不在活细胞，它适合所有类型的蛋白质样品，而不像SILAC，不能对组织来源的蛋白质进行分析；第三，iTRAQ标记目前可使4-8个样本同时相对量化，大大降低了实验过程中所引入的技术误差，而ICAT标记只限于2个样本，SILAC至今只有3个被使用。由于米曲霉在酱油发酵中占有非常重要的作用，因此人们也特别想了解米曲霉在发酵过程中产生的对风味有重要影响的主要蛋白酶的类型、特征等，但是，目前还没有一种能够快速分析米曲霉发酵过程中主要蛋白酶的方法，因此亟需一种新的分析方法。通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服传统进行蛋白质定量的局限性，提供一种快速分析米曲霉发酵过程中主要蛋白酶的方法，该方法能够快速分析米曲霉发酵过程中分泌的各类型蛋白酶，提高了分析速度，给使用带来了方便，提高了工作效率。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种快速分析米曲霉发酵过程中主要蛋白酶的方法，步骤如下：⑴蛋白质提取①胰蛋白酶裂解蛋白质溶液中添加二硫苏糖醇至10mM，37℃保温1h；添加碘乙酰胺至20mM，室温避光放置45min，进行甲基化；使用100mM四乙基溴化铵对蛋白质溶液稀释至尿素浓度小于2M；一次酶解，按照胰蛋白酶：蛋白质样品的质量比为1:50的比例添加胰蛋白酶，静置过夜；二次酶解，按照胰蛋白酶：蛋白质样品的质量比为1:100的比例添加胰蛋白酶，静置4h，胰蛋白酶裂解即完成，得样品；②TMT标记每份样品取100μg使用StrataXC18SPE柱脱盐，然后真空干燥；样品使用0.5M四乙基溴化铵重悬，然后加入6倍体积的TMT试剂；一个单位的TMT试剂，是指每100μg蛋白质样品要求使用的标记试剂，溶解于24μL乙腈；多肽样品混合物室温放置2h，然后脱盐、真空离心干燥；③HPLC分离使用安捷伦300C18反相柱进行纯化，5μm，4.6×250mm；A液：乙腈，B液：10mMpH10碳酸氢铵缓冲液，条件为：2％-60％乙腈线性洗脱，80min，收集80管样品；最后样品被合并成10组，分别进行真空离心干燥，得多肽样品；⑵LC-MS/MS蛋白质定量分析①LC-MS/MS分析：多肽样品溶解于体积百分数为0.1％的甲酸中，直接上样到反向预装柱中，分离多肽，A液为体积百分数为0.1％的甲酸，B液为体积百分数为98％的乙腈，梯度洗脱条件为：乙腈由体积百分数为7％升至体积百分数22％，26min；体积百分数为22％升至体积百分数为35％，8min，体积百分数为35％升至体积百分数为80％，3min；体积百分数为80％保持3min；在EASY-nLC1000UPLC系统中保持300nL/min的恒定流速，然后通过质谱进行分析；校正仪器是误差低于10ppm，离子采集范围为350-1800m/z；②数据库检索：MS/MS数据使用Mascotv.2.3.0进行分析；串联质谱的数据基于UniprotAspergillusoryzae进行检索；胰蛋白酶是指定的裂解酶，允许最多两个断裂位点的缺失；片段质量误差为±0.01Da；考虑甲硫氨酸和半胱氨酸的氨基甲酰化变化修饰；蛋白质定量的Mascot报告中，设定多肽离子分数≥20；即可快速分析发酵过程中主要蛋白酶。而且，所述步骤⑴①中蛋白质溶液的制备步骤如下：称取不同采样时间的大曲发酵物，加入去离子水，大曲发酵物：去离子水的比例为1：10g：mL，然后将其放入40℃恒温水浴锅中水浴lh，间隔15min震荡一次，以保证所有大曲浸没在水中；水浴完成后，单层滤纸过滤后，7000g，4℃离心10min，除去不溶性杂质，然后过0.45μm的水系滤膜，除去杂质，得到的滤液用30％-80％饱和度的硫酸铵进行分级沉淀，4℃静置过夜，然后8000g/min、4℃，离心10min，弃上清所得到的沉淀蛋白用0.02MpH7.5的Tris-HCl缓冲液进行溶解，质量浓度为55％时为酶活最高的溶液，即得蛋白质溶液。而且，所述步骤⑴①中蛋白质溶液的制备步骤如下：收集液体发酵过程中的米曲霉液体，10000rpm，4℃，离心10min，上清过0.45μm的水系滤膜，除去杂质，得到的滤液用30％-80％饱和度的硫酸铵进行分级沉淀，4℃静置过夜，然后8000g/min，4℃，离心10min，弃上清所得到的沉淀蛋白用0.02mol/LpH7.5的Tris-HCl缓冲液进行溶解，质量浓度为55％时为酶活最高的溶液，即得蛋白质溶液。而且，所述步骤⑵①中的反向预装柱为AcclaimPepMap100,ThermoScientific。而且，所述步骤⑵①中的质谱为QExactiveTMplushybridquadrupole-Orbitrap质谱。而且，所述步骤⑵②中的主要蛋白酶为肽水解酶、α/β-折叠蛋白水解酶、二肽基肽酶、Xaa-脯氨酸氨肽酶、嘌呤霉素敏感本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速分析米曲霉发酵过程中主要蛋白酶的方法，其特征在于：步骤如下：⑴蛋白质提取①胰蛋白酶裂解蛋白质溶液中添加二硫苏糖醇至10mM，37℃保温1h；添加碘乙酰胺至20mM，室温避光放置45min，进行甲基化；使用100mM四乙基溴化铵对蛋白质溶液稀释至尿素浓度小于2M；一次酶解，按照胰蛋白酶：蛋白质样品的质量比为1:50的比例添加胰蛋白酶，静置过夜；二次酶解，按照胰蛋白酶：蛋白质样品的质量比为1:100的比例添加胰蛋白酶，静置4h，胰蛋白酶裂解即完成，得样品；②TMT标记每份样品取100μg使用Strata X C18 SPE柱脱盐，然后真空干燥；样品使用0.5M四乙基溴化铵重悬，然后加入6倍体积的TMT试剂；一个单位的TMT试剂，是指每100μg蛋白质样品要求使用的标记试剂，溶解于24μL乙腈；多肽样品混合物室温放置2h，然后脱盐、真空离心干燥；③HPLC分离使用安捷伦300C18反相柱进行纯化，5μm，4.6×250mm；A液：乙腈，B液：10mM pH10碳酸氢铵缓冲液，条件为：2％‑60％乙腈线性洗脱，80min，收集80管样品；最后样品被合并成10组，分别进行真空离心干燥，得多肽样品；⑵LC‑MS/MS蛋白质定量分析①LC‑MS/MS分析：多肽样品溶解于体积百分数为0.1％的甲酸中，直接上样到反向预装柱中，分离多肽，A液为体积百分数为0.1％的甲酸，B液为体积百分数为98％的乙腈，梯度洗脱条件为：乙腈由体积百分数为7％升至体积百分数22％，26min；体积百分数为22％升至体积百分数为35％，8min，体积百分数为35％升至体积百分数为80％，3min；体积百分数为80％保持3min；在EASY‑nLC 1000UPLC系统中保持300nL/min的恒定流速，然后通过质谱进行分析；校正仪器是误差低于10ppm，离子采集范围为350‑1800m/z；②数据库检索：MS/MS数据使用Mascot v.2.3.0进行分析；串联质谱的数据基于Uniprot Aspergillus oryzae进行检索；胰蛋白酶是指定的裂解酶，允许最多两个断裂位点的缺失；片段质量误差为±0.01Da；考虑甲硫氨酸和半胱氨酸的氨基甲酰化变化修饰；蛋白质定量的Mascot报告中，设定多肽离子分数≥20；即可快速分析发酵过程中主要蛋白酶。...
【技术特征摘要】
1.一种快速分析米曲霉发酵过程中主要蛋白酶的方法，其特征在于：步骤如下：⑴蛋白质提取①胰蛋白酶裂解蛋白质溶液中添加二硫苏糖醇至10mM，37℃保温1h；添加碘乙酰胺至20mM，室温避光放置45min，进行甲基化；使用100mM四乙基溴化铵对蛋白质溶液稀释至尿素浓度小于2M；一次酶解，按照胰蛋白酶：蛋白质样品的质量比为1:50的比例添加胰蛋白酶，静置过夜；二次酶解，按照胰蛋白酶：蛋白质样品的质量比为1:100的比例添加胰蛋白酶，静置4h，胰蛋白酶裂解即完成，得样品；②TMT标记每份样品取100μg使用StrataXC18SPE柱脱盐，然后真空干燥；样品使用0.5M四乙基溴化铵重悬，然后加入6倍体积的TMT试剂；一个单位的TMT试剂，是指每100μg蛋白质样品要求使用的标记试剂，溶解于24μL乙腈；多肽样品混合物室温放置2h，然后脱盐、真空离心干燥；③HPLC分离使用安捷伦300C18反相柱进行纯化，5μm，4.6×250mm；A液：乙腈，B液：10mMpH10碳酸氢铵缓冲液，条件为：2％-60％乙腈线性洗脱，80min，收集80管样品；最后样品被合并成10组，分别进行真空离心干燥，得多肽样品；⑵LC-MS/MS蛋白质定量分析①LC-MS/MS分析：多肽样品溶解于体积百分数为0.1％的甲酸中，直接上样到反向预装柱中，分离多肽，A液为体积百分数为0.1％的甲酸，B液为体积百分数为98％的乙腈，梯度洗脱条件为：乙腈由体积百分数为7％升至体积百分数22％，26min；体积百分数为22％升至体积百分数为35％，8min，体积百分数为35％升至体积百分数为80％，3min；体积百分数为80％保持3min；在EASY-nLC1000UPLC系统中保持300nL/min的恒定流速，然后通过质谱进行分析；校正仪器是误差低于10ppm，离子采集范围为350-1800m/z；②数据库检索：MS/MS数据使用Mascotv.2.3.0进行分析；串联质谱的数据基于UniprotAspergillusoryzae进行检索；胰蛋白酶是指定的裂解酶，允许最多两个断裂位点的缺失；片段质量误差为±0.01Da；考虑甲硫氨酸和半胱...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈卫，赵国忠，刘艳凤，印伯星，房东升，孙晓琪，张秋香，陆文伟，毛丙永，张白曦，田丰伟，翟齐啸，范大明，刘小鸣，王刚，赵建新，张灏，
申请(专利权)人：扬州市扬大康源乳业有限公司，江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。