本发明专利技术涉及一种发酵法生产木糖醇，包括以下步骤：富含多缩戊糖植物原料水解得水解产物，水解产物经提纯、解毒得木糖溶液；将热带假丝酵母接种于YPD平板培养基上30℃培养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于 100mL 的液体培养基中生长，再按照 2％的接种量接种于 1000mL 以 3％木糖为唯一碳源的液体培养基中在30℃，200rpm下发酵24h。本发明专利技术用于生产低聚果糖操作简单、作用条件温和、易掌握，木糖 - 木糖醇的转化率最高提高到了91.4％，发酵时间需要不到2h即可，大大提高了发酵法生产木糖醇的产量，是发酵工艺中的重大的创新，值得推广。
【技术实现步骤摘要】
（一）
本专利技术涉及木糖醇，具体涉及发酵法生产木糖醇。（二）
技术介绍
木糖醇是一种重要的功能性多元糖醇,木糖醇在体内代谢不需要胰岛素的参与,食用后不会提高血糖值,可用于糖尿病食品中。它在口腔中不会被微生物发酵,可防止龋齿发生。木糖醇还可作为非肠道营养的能量来源等。正是因为木糖醇具有以上功能特性,它被广泛应用于食品和医药等工业。木糖醇的生产方法可分成三种:提取、化学合成、生物合成。目前,工业生产主要采用化学合成法。生物合成法是利用微生物中的还原酶来生产木糖醇,它可有效降低木糖醇的生产成本。发酵法不仅有可能省去木糖纯化步骤,还可以简化木糖醇的分离步骤,是一种很有前途的生产方法。自然界的微生物中，酵母比较容易将木糖转化生成木糖醇。其中，产木糖醇性能优越的酵母菌株主要集中于假丝酵母属 (Candida)，如季乐蒙地假丝酵母 (C.guilliermondii)、热 带 假 丝 酵 母 (C.tropicalis)、莫 基 假 丝 酵 母 (C.mogii)、平 滑 假 丝 酵 母(C.parasilosis) 等等。工业化生产主要使用热带假丝酵母。酵母对 D- 木糖的转化途径首先是木糖还原酶以 NADPH 或 NADH 为辅酶 ( 主要是 NADPH) ；将 D- 木糖还原为木糖醇，木糖醇既可以作为主要产物进入培养基内，也可以被以 NAD+为辅酶的木糖醇脱氢酶催化氧化成D- 木酮糖，最后进入磷酸戊糖代谢途径。酵母代谢木糖时会经过 D- 木酮糖途径，消耗一部分已经生成的木糖醇，所以木糖醇转化率一般只能达到理论值的 65％～ 90％。但在实际工业化生产过程中，木糖 - 木糖醇转化率只有 50％～ 70％。酵母中的木糖还原酶的活性受到温度、pH、NADPH 浓度和离子浓度的影响，而该酶的活性直接影响到木糖 - 木糖醇的转化率。如何提高工业化生产中木糖 - 木糖醇转化率，一直是本领域亟待解决的问题。2010年8月4公开的一种提高木糖醇得率的发酵方法，提出了向培养基中添加 Zn2+至终浓度 0.3 ～0.6mmol/L以提高木糖醇发酵得率。木糖 - 木糖醇的转化率从 68％提高到了 79％。转化率提高率仍是有限，需要进一步加强，本专利技术是在上述方案的技术上进行进一步的研究。（三）
技术实现思路
本专利技术为了弥补现有技术的不足，提供了一种发酵法生产木糖醇，操作方便，过程易于控制，反应时间短，有利于工业化生产。本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种发酵法生产木糖醇，其特殊之处在于：包括以下步骤：（1）制备木糖溶液：富含多缩戊糖植物原料水解得水解产物，水解产物经提纯、解毒得木糖溶液；（2）菌株发酵：将热带假丝酵母接种于YPD平板培养基上30℃培养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于 100mL 的液体培养基中生长，再按照 2％的接种量接种于 1000mL 以 3％木糖为唯一碳源的液体培养基中在30℃，200rpm下发酵24h；（3）种子培养 ：10g/L 木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4·7H2O、2.5g/L KH2PO4 ；装液量为 50mL/250mL，培养基 pH 值自然，接入斜面种子，30℃，180rpm 摇床上培养 20h；（4）发酵木糖产木糖醇 ：按 2％的接种量将液体种子接入发酵瓶中，培养基组份为木糖 100 g/L、酵母膏 10.0 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4·7H2O 4 g/L、KH2PO43 g/L、(NH4)2HPO4，装液量为120mL/250mL、CaCl2 0.4 g/L，氟硼酸锌4g/L，培养基 pH 值自然，往发酵瓶中，分别添加Fe3+、 Zn2+，使其达到8-10mmol/L、1-4mmol/L，于 30℃，200rpm，250mL 摇瓶培养40min-2h 后终止。本专利技术的发酵法生产木糖醇，富含多缩戊糖植物原料为玉米芯、草木樨中的至少一种。本专利技术的有益效果：本专利技术用于生产低聚果糖操作简单、作用条件温和、易掌握，木糖 - 木糖醇的转化率最高提高到了91.4％，发酵时间需要不到2h即可，大大提高了发酵法生产木糖醇的产量，是发酵工艺中的重大的创新，值得推广。（四） 具体实施方式实施例1现有发酵法生产木糖醇工艺，其步骤：（1）菌株发酵将热带假丝酵母 (Candida tropicalis ACCC 20148，购于中国农业微生物菌种保藏管理中心)接种于YPD(Y ：yeast extract，P ：peptone，D ：glucose)平板培养基上30℃培养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于 100mL 的液体培养基中生长，再按照 2％的接种量接种于 1000mL 以 3％木糖为唯一碳源的液体培养基中发酵。发酵条件为 30℃，200rpm，24h。（2）木糖还原酶的纯化及酶活测定纯化 ：将实施例 1 中发酵完毕的发酵液低温离心并收集菌体，超声波破碎后取上清，将上清 pH 调到 7.0。2. 在 4℃条件下添加 40％饱和度硫酸铵，静置 4 ～ 6h，低温离心去除杂蛋白，然后再添加硫酸铵使溶液的饱和度为 80％，4℃静置 20h，离心收集沉淀，沉淀部分溶于少量 20mmol/L pH7.0 的 Tris-HCl 缓冲液中，并用 Tris-HCl 缓冲液充分透析。3. 低温离心取上清。4. 将步骤 3 中浓缩的酶液上样到 DEAE-Sepharose 柱层析中，在充分洗去杂蛋白后洗脱，流速为1.0mL/min，洗脱液为20mmol/L pH7.0的Tris-HCl，活性部分被含 0.5MNaCl 的洗脱液洗脱下来，收集蛋白峰。5. 用 10KDα 的 YM 超滤膜及 Amicon 超滤杯借助 N2 压 ( 压力为 0.4Mpa) 对收集的活性部分进行超滤浓缩、除盐获得纯化产物。酶活力测定 ：用分光光度计在 340nm 波长处检测还原型辅酶 NADH 特异吸收值的降低速率，间接检测酶活力大小。具体参数为 ：木糖还原酶液 50μL，NADH 0.15mmol/L，木糖 0.1mol/L，缓冲液为 PBS(0.05mol/L，pH7.0)，反应温度为 30℃，总体积为 2.5mL。酶活力单位定义为每分钟消耗 1μmol NADH 所需的酶量为 1 个酶活单位。蛋白测定方法采用考马斯亮蓝 G-250 法。经测定纯化后的木糖还原酶的比活力达 12U/mg。Zn2+浓度对木糖 - 木糖醇转化率的影响1. 培养基中 Zn2+浓度测定 ：分别选取 10g 不同厂家的酵母膏，配置 1L 溶液，用HI93731 锌浓度测定仪检测其中 Zn2+浓度，经检测，其 Zn2+浓度在 8 ～ 11mg/L 之间。2. 种子培养 ：10g/L 木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4·7H2O、2.5g/L KH2PO4 ；装液量为 50mL/250mL本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种发酵法生产木糖醇，其特征在于：包括以下步骤：（1）制备木糖溶液：富含多缩戊糖植物原料水解得水解产物，水解产物经提纯、解毒得木糖溶液；（2）菌株发酵：将热带假丝酵母接种于YPD平板培养基上30℃培养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于 100mL 的液体培养基中生长，再按照 2％的接种量接种于 1000mL 以 3％木糖为唯一碳源的液体培养基中在30℃，200rpm下发酵24h；（3）种子培养 ：10g/L 木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4·7H2O、2.5g/L KH2PO4 ；装液量为 50mL/250mL，培养基 pH 值自然，接入斜面种子，30℃，180rpm 摇床上培养 20h；（4）发酵木糖产木糖醇 ：按 2％的接种量将液体种子接入发酵瓶中，培养基组份为木糖 100 g/L、酵母膏 10.0 g/L、NaCl 10 g/L、MgSO4·7H2O 4 g/L、KH2PO43 g/L、(NH4)2HPO4，装液量为120mL/250mL、CaCl2 0.4 g/L，氟硼酸锌4g/L，培养基 pH 值自然，往发酵瓶中，分别添加Fe3+、 Zn2+，使其达到8‑10mmol/L、1‑4mmol/L，于 30℃，200rpm，250mL 摇瓶培养40min‑2h 后终止。...
【技术特征摘要】
1.一种发酵法生产木糖醇，其特征在于：包括以下步骤：
（1）制备木糖溶液：富含多缩戊糖植物原料水解得水解产物，水解产物经提纯、解毒得木糖溶液；
（2）菌株发酵：将热带假丝酵母接种于YPD平板培养基上30℃培养活化，然后用无菌牙签转接单菌落于 100mL 的液体培养基中生长，再按照 2％的接种量接种于 1000mL 以 3％木糖为唯一碳源的液体培养基中在30℃，200rpm下发酵24h；
（3）种子培养 ：10g/L 木糖、5g/L 酵母膏、0.2g/L MgSO4·7H2O、2.5g/L KH2PO4 ；装液量为 50mL/250mL，培养基 pH 值自然，接入斜面种子，30℃，180rpm 摇床上培养 20...
【专利技术属性】
技术研发人员：窦光朋，张继红，窦宝德，
申请(专利权)人：山东百龙创园生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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