一种构建重组酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种构建重组酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于代谢工程领域。本发明专利技术通过在酵母中表达肌醇-1-磷酸合成酶基因(Ino1)、肌醇加氧酶基因(MIOX)，实现葡萄糖醛酸的生成途径，同时表达来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的醛酸脱氢酶(Udh)，成功构建了葡萄糖二酸的合成途径。其中，重组毕赤酵母在YPD发酵培养基中生成葡萄糖二酸40mg/L，在YPD-MI(YPD培养基中加入60mM肌醇)发酵培养基中生成葡萄糖二酸60mg/L。本发明专利技术提出的重组酵母发酵生成葡萄糖二酸的方法，具有广阔的发展前景，为生物合成葡萄糖二酸奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种构建重组酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法
本专利技术涉及一种构建重组酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于代谢工程领域。
技术介绍
葡萄糖二酸(glucuricacid，saccharicacid)又名葡萄糖质酸，是葡萄糖的醛基及C-6上羟基均被氧化成羧酸(如硝酸作用)而形成的糖酸。熔点125～126℃，溶于水和乙醇，稍溶于乙醚，是β葡萄糖醛酸酶的抑制剂。葡萄糖二酸及其衍生物在一些植物及哺乳动物中均有发现，特别是在一些十字花科蔬菜、草莓和柑橘类水果中含量丰富。葡萄糖二酸具有重要的生物功能，被美国能源部确定为“最有价值的生物炼制产品”。它可以降低胆固醇、用于癌症的治疗，同时其钙盐也是一种食品添加剂。葡萄糖二酸在水溶液中不稳定，易转变为葡萄糖二酸内酯的形式，二者在水溶液处于互变平衡状态。葡萄糖二酸1,4内酯也是一种重要的功能产品，它可使肝素、透明质酸、硫酸粘多糖以及葡萄糖醛酸的破坏大大减少，帮助身体有效的排除毒素，并能够缓解关节炎、痛风、气喘和相关组织功能下降所引起的其他不适。葡萄糖二酸由于对人体无毒，并且其结构域单糖结构相似，可以通过糖转运系统进入细胞内部，能够在病灶部位聚集，并少量被缺血组织快速吸收，因此可以作为显像剂应用于心肌梗死和肿瘤的研究中。同时，葡萄糖二酸也可用作聚合物的组成部分，比如新型尼龙和超支化聚酯。葡萄糖二酸已成功利用在生产羟化尼龙上，这种材料是一种环保型的可生物降解的新材料。目前葡萄糖二酸的制备方法主要为化学法，如硝酸氧化、以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)为催化剂的共催化氧化等。硝酸氧化法主要是以葡萄糖为原料，通过硝酸氧化为葡萄糖二酸及其小分子物质。此种方法生成的产物较多，副产物复杂，同时产生大量气体，其反应废液对环境产生污染，因此逐渐被新方法取代。2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基(TEMPO)氧化体系是近年来发展起来的一种新的方法，TEMPO属于亚硝酰自由基，是一种稳定的自由基，其氮氧自由基通过不成对电子在氮氧之间移动形成了共振结构。TEMPO氧化体系对糖类伯羟基的氧化选择性高、反应条件温和、能避免降解。由于葡萄糖二酸的水溶液易形成葡萄糖1，4-内酯及葡萄糖6,3-内酯，所以在制备过程中以制得单钾盐为最终产物。此方法所用TEMPO可回收利用，产物纯化容易，便于操作，是目前常用的一种方法。但是由于反应过程中的反应温度及pH不易控制，因此仍然需要改进。由于化学法所存在的局限较多，通过生物法来制备葡萄糖二酸越来越受到研究者的关注。葡萄糖二酸是存在于哺乳动物的代谢途径中，它与抗坏血酸是葡萄糖醛酸代谢途径的终产物。然而，从D-葡萄糖或D-半乳糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反应。Prather等通过重组大肠杆菌，分别从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和小鼠体内获取肌醇-1-磷酸合成酶(Ino1)和肌醇氧化酶(MIOX)，从丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)获得醛酸脱氢酶基因，克隆到大肠杆菌中，实现了葡萄糖二酸的生物合成。酵母是单细胞低等真核生物，既有原核生物细胞容易培养、生长速度快、操作简单，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能。由于它培养时营养要求低、生长快、培养基廉价、可进行高密度发酵培养，因此是一种可用于生产目标生物产品的优良宿主。目前尚未发现有通过重组酵母来发酵生产葡萄糖二酸的报道，原始的酵母菌株并不能生成葡萄糖二酸，鉴于此，本专利技术中构建的新型重组工程菌，在微生物发酵生产葡萄糖二酸方面，提供了新的方法与思路。
技术实现思路
本专利技术通过将肌醇-1-磷酸合成酶基因(Ino1)、肌醇加氧酶基因(MIOX)及醛酸脱氢酶基因(Udh)克隆表达至酵母菌株中，构建重组酵母，该重组酵母菌能以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物合成葡萄糖二酸。本专利技术提供一种重组酵母菌，该重组酵母菌同时表达肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh。所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1来源于以下任意一种：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)。所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1，在本专利技术的一种实施方式中，来源于PichiapastorisGS115。所述肌醇加氧酶基因MIOX来源于以下任意一种：小鼠(mouse)、毕赤酵母(PichiapastorisGS115)、白假丝酵母(Candidaalbicans)。所述肌醇加氧酶基因MIOX，在本专利技术的一种实施方式中，来源于PichiapastorisGS115。所述醛酸脱氢酶基因Udh来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)。所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh，在本专利技术的一种实施方式中，其氨基酸序列分别是SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示的序列。所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh，在本专利技术的一种实施方式中，其核苷酸序列分别是SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示的序列。所述醛酸脱氢酶基因Udh前有GAP启动子。所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1前有毕赤酵母组成型启动子TEF。所述重组酵母菌的出发宿主菌为以下任意一种：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、解脂假丝酵母(Candidalipolytica)、毕赤酵母(Pichiapastoris)。所述肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇加氧酶基因及醛酸脱氢酶基因为整合表达。本专利技术还提供一种所述重组酵母菌的构建方法，包括：(1)在Udh基因前融合GAP启动子构成融合片段，连接到表达载体后转化到酵母宿主菌中，得到重组菌；(2)将MIOX基因、组成型启动子TEF、Ino1基因按顺序融合，连接到表达载体上再转化到步骤1得到的重组菌中。所述构建方法，具体是：(1)PichiapastorisGS115/Udh的构建：以恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的基因组为模板扩增Udh基因，以pGAPZB质粒为模板扩增GAP启动子，将GAP启动子与Udh基因融合成上下游分别引入了酶切位点SacI、NotI的融合片段，并连接到表达载体pPIC9K上，筛选获得正确的重组质粒，命名为pPIC9K-GAP-Udh，将重组质粒转化到宿主PichiapastorisGS115中即得到PichiapastorisGS115/Udh；(2)以PichiapastorisGS115基因组为模板扩增MIOX基因、Ino1基因，以pGAPZB质粒为模板扩增毕赤酵母组成型启动子TEF，将MIOX、TEF、Ino1按顺序融合，并在融合片段两端添加XhoI，XbaI酶切位点，将融合片段连接到表达载体pGAPZB后，用BspHI线性化后电转入步骤1构建的表达宿主PichiapastorisGS115/Udh中，筛选正确的重组酵母菌，命名为PichiapastorisGS115/Udh-MTI。本专利技术还提供一种利用所述重组酵母菌生产葡萄糖二酸的方法，其特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组酵母菌，其特征在于，所述重组酵母菌同时表达肌醇‑1‑磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh。

【技术特征摘要】
1.一种重组酵母菌，其特征在于，所述重组酵母菌同时表达肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh；所述肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1、肌醇加氧酶基因MIOX、醛酸脱氢酶基因Udh的氨基酸序列分别是SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3所示的序列；所述重组酵母菌的出发宿主菌为毕赤酵母；所述肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇加氧酶基因及醛酸脱氢酶基因为整合表达；所述重组酵母菌的构建方法包括如下步骤：(1)在Udh基因前融合GAP启动子构成融合片段，连接到表达载体后转化到酵母宿主菌中，得到重组菌；(2)将MIOX基因、组成型启动子TEF、Ino1基因按顺序融合，连接到表达载体上再转化到步骤(1)得到的重组菌中。2.一种权利要求1所述重组酵母菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括：(1)在Udh基因前融合GAP启动子构成融合片段，连接到表达载体后转化到酵母宿主菌中，得到重组菌；(2)将MIOX基因、组成型启动子TEF、Ino1基因按顺序融合，连接到表达载体上再转化到步骤(1)得到的重组菌中。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括：(1)PichiapastorisGS115/Udh的构建：以恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的基因组为模板扩增Udh基因，以pGAPZ...

【专利技术属性】
技术研发人员：康振，陈坚，堵国成，王淼，刘叶，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32