一种降低木质素含量的代谢途径改造方法及应用技术

本发明专利技术涉及基因工程领域，具体而言是一种通过在植物中构建2-苯乙醇合成通路以降低木质素合成，进而提高纤维生物质转化效率的方法与应用。2-苯乙醇合成通路来自酵母，包含三个关键基因，分别是氨基酸转氨酶基因ARO9，丙酮酸脱羧酶基因ARO10和乙醇脱氢酶基因ADH2。本发明专利技术在拟南芥中构建一条2-苯乙醇合成的途径，通过2-苯乙醇的合成与木质素合成竞争起始底物苯丙氨酸，引起碳代谢的分流，实现转基因植物中木质素合成减少。本发明专利技术主要的目的是通过降低植物中木质素合成，从而降低纤维生物质预处理的难度。目前，在拟南芥中本方法已表现出降低木质素合成，同时提高茎秆细胞壁提取物酶解释放葡萄糖效率的特性。

【技术实现步骤摘要】
一种降低木质素含量的代谢途径改造方法及应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体而言是一种通过在转基因植物中构建2-苯乙醇合成通路以降低木质素合成的方法和应用。
技术介绍
木质纤维生物质(biomass)是地球上最丰富的可再生资源。其转化产品丰富，可转化为生物燃料及生物基化学品等多种产品。随着矿物资源的日益短缺,以及使用石油等矿物资源所带来的环境污染和气候恶化，纤维生物质资源的开发利用已在世界范围内引起了广泛的关注。木质素是木质纤维生物质的主要成分之一，其存在一直是限制纤维生物质高效转化利用的主要屏障。以前的研究结果证明，通过基因工程技术改变能源植物木质素的含量和成分能够显著降低原材料预处理强度，同时提高纤维素的降解效率和生物乙醇的发酵产量。因此，开发高效转化利用的新型纤维生物质能源植物是解决生物质利用困难的关键瓶颈之一，具有重要的应用价值。木质素(lignin)是高等植物细胞壁的重要组分，是一类组成和结构十分复杂的芳香类聚合物，主要有H-木质素、S-木质素和G-木质素3种主要的木质素类型。木质素的合成代谢途径在双子叶植物中被广泛深入地研究。其生物合成以苯丙氨酸为起始底物,进入苯丙酸途径，经过一系列反应合成羟基肉桂酸类化合物，最终生成3种主要木质素单体。目前，国内外关于木质素合成途径和遗传调控的研究，主要集中于双子叶植物。木质素单体合成途径的10个酶基因（PAL、C4H、HCT、C3H、CES、4CL、CCoAOMT、CCR、F5H、COMT和CAD）的功能在拟南芥中已经基本研究清楚，其中许多关键基因已应用于植物木质素生物合成调控。目前的植物木质素基因工程的研究策略主要是通过调控木质素合成关键基因的表达来实现木质素含量的降低或组成结构的改变，从而使木质素更易于去除,进而利于纤维生物质的转化利用。为了给木质素分子改良提供更多选择和策略，本专利技术以木质素合成的起始底物苯丙氨酸为切入点，在拟南芥中构建一条2-苯乙醇合成的途径，希望通过2-苯乙醇的合成与木质素合成竞争起始底物苯丙氨酸，引起碳代谢的分流，实现转基因植物中木质素合成的减少。2-苯乙醇是一种具有玫瑰花香的芳香醇，作为香料广泛应用于日化、轻工和食品等领域。其合成途径在酿酒酵母都得到了较深入的研究，植物中2-苯乙醇合成研究相对较少，在植物中存在三条不同途径。与木质素合成相似，酵母中2-苯乙醇的合成都是以苯丙氨酸作为起始底物。目前在拟南芥中，尚未有2-苯乙醇合成的报道。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种通过在植物中构建一条2-苯乙醇合成通路，与木质素合成竞争底物苯丙氨酸，从而降低植物木质素含量的代谢途径改造方法及应用。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种2-苯乙醇合成通路，其特征在于：所述合成通路来自酵母，包含三个关键基因，分别是氨基酸转氨酶基因ARO9(GenBank序列号：NM_001179267)，丙酮酸脱羧酶基因ARO10(NM_001180688)和乙醇脱氢酶基因ADH2(NM_001182812)。一种2-苯乙醇合成通路应用，其特征在于：所述2-苯乙醇合成通路在降低植物茎秆木质素含量以提高纤维生物质转化效率的应用。一种2-苯乙醇合成通路的植物表达载体，其特征在于：所述合成通路的植物表达载体包含两个，一个包含ARO9和ARO10两个基因，另一个包含ADH2基因，二者分别具有组成型启动子。所述两个载体的T-DNA区中还分别包含不同的用于筛选转基因植物的标记基因。所述组成型启动子分别为CaMV35S启动子和pROLD启动子。所述2-苯乙醇合成通路分别为ARO9、ARO10和ADH2基因。所述植物为纤维类能源植物。所述植物表达载体在降低植物茎秆木质素含量以提高纤维生物质转化效率的应用。本专利技术所具有的优点：本专利技术构建了2-苯乙醇合成通路的植物表达载体，包含用所述载体转化的拟南芥，以及在拟南芥中降低木质素合成的方法。而利用本专利技术描述的方法对拟南芥木质素合成进行系统的代谢工程改造，使得植物木质素含量下降约11%，茎秆细胞壁提取物酶解释放葡萄糖效率显著提高，同时对转基因植株的正常生长没有影响，其具有较大的研究价值和应用潜力。附图说明图1为本专利技术实施例提供的2-苯乙醇合成通路的植物表达载体的构建示意图。图2为本专利技术实施例提供的转化2-苯乙醇合成通路的拟南芥转基因植株。其中，对照（Control）为转入空载体的转基因拟南芥。图3为本专利技术实施例提供的RT-PCR分析ARO9、ARO10和ADH2基因在转基因拟南芥中的表达水平示意图。其中，对照（Control）为转入空载体的转基因拟南芥；1，2，3，4和5代表为转基因拟南芥株系。拟南芥ACTIN2基因用作内参。图4为本专利技术实施例提供的转化2-苯乙醇合成通路的拟南芥转基因植株茎横切面的木质素间苯三酚染色分析。其中，对照（Control）为转入空载体的转基因拟南芥；ARO9&ARO10&ADH2-OE为ARO9、ARO10和ADH2基因过表达株系。Bar=200µm。图5为本专利技术实施例提供的转化2-苯乙醇合成通路的拟南芥转基因植株茎木质素含量测定。其中，对照（Control）为转入空载体的转基因拟南芥；ARO9&ARO10&ADH2-OE为ARO9、ARO10和ADH2基因过表达株系。*表示差异显著（P<0.05）。图6为本专利技术实施例提供的纤维素酶水解拟南芥茎细胞壁提取物的效率分析。其中，对照（Control）为转入空载体的转基因拟南芥；ARO9&ARO10&ADH2-OE为ARO9、ARO10和ADH2基因过表达株系。具体实施方式本实验所涉及的药品均购自Sigma公司、Fermentas公司、ThermoFisher公司、上海生工公司。具体实验操作依据《分子克隆》。实施例12-苯乙醇合成通路的植物表达载体的构建：1.酵母2-苯乙醇合成通路基因：ARO9、ARO10和ADH2基因的克隆为了在植物中构建2-苯乙醇合成通路，根据酿酒酵母中2-苯乙醇合成通路的报道，选择ARO9(NM_001179267)、ARO10(NM_001180688)和ADH2(NM_001182812)构建2-苯乙醇合成通路。取酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）提取其基因组DNA，搜索GenBank获得二者的全长cDNA序列，分别设计基因特异引物，利用PCR技术扩增三者的基因全长cDNA;最后将二者连入pMD19-T中测序。扩增条件为：95℃5min预变性；9430s,55℃40s,72℃1min,35个循环；72℃8min片段延伸。扩增引物为：ARO9cDNAF:5’-ATGACTGCTGGTTCTGCCCCCCCT-3’；ARO9cDNAR:5’-TCAACTTTTATAGTTGTCAAAAAAT-3’；ARO10cDNAF:5’-ATGGCACCTGTTACAATTGAAAAG-3’；ARO10cDNAR:5’-CTATTTTTTATTTCTTTTAAGTGCCG-3’；ADH2cDNAF:5’-ATGTCTATTCCAGAAACTCAAAAAG-3’；ADH2cDNAR:5’-TTATTTAGAAGTGTCAACAACGTAT-3’。2.2-苯乙醇合成通路本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种2‑苯乙醇合成通路，其特征在于：所述合成通路来自酵母，包含三个关键基因，分别是氨基酸转氨酶基因ARO9，丙酮酸脱羧酶基因ARO10和乙醇脱氢酶基因ADH2。

【技术特征摘要】
1.一种能够降低植物茎秆木质素含量的2-苯乙醇合成通路的植物表达载体，其特征在于：表达载体含合成通路，合成通路为一个包含氨基酸转氨酶基因ARO9和丙酮酸脱羧酶基因ARO10两个基因，另一个包含乙醇脱氢酶基因ADH2基因，二者分别具有组成型启动子。2.如权利要求1所述的2-苯乙醇合成通路的植物表达载体，其特征在于：所述载体还包含用于筛选转基因植株的标记基因。3.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：周功克，祁广，柴国华，孔英珍，王殿，唐贤丰，胡瑞波，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37