毛白杨木质素单体合成基因４－ＣＬ及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种毛白杨木质素单体合成基因４－ＣＬ及应用。该基因负责催化各种肉桂酸及其衍生物生成相应的辅酶Ａ酯，参与各种下游次生产物的合成，是调控木质素合成的关键基因。研究结果表明，木质素含量的增加增强了植物抵抗病原物的侵染，提高了油菜茎秆强度，使其抗倒伏性明显增强。具体结果表现为转基因油菜木质素含量比受体对照木质素含量增加１０％以上；转基因植株叶片比受体对照病斑扩展面积变小３０％左右；转基因植株茎秆强度比对照增强达２０％左右。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，具体地说，本专利技术涉及一种毛白杨木质素 单体合成基因4-CL序列，同时本专利技术还涉及这种木质素单体合成基因4-CL在 甘蓝型油菜中的用途。
技术介绍
木质素作为植物体内一类复杂的苯丙垸类聚合物，是植物机械组织和细胞 壁的主要成分之一，在植物生长发育和抗逆性方面具有重要的作用。在细胞壁木 质化过程中，木质素渗入到细胞壁中，填充于细胞壁架构内，增强了细胞壁的硬 度，强化了细胞的机械支持力和抗压强度。在与病原菌相互作用中，寄主细胞壁 木质化是抗病反应的特征之一，木质素作为植物体内一种重要的物理抗菌物质， 能够沉积于细胞壁中富含羟脯氨酸的糖蛋白(服GP)上，作为结构屏障，加固细 胞壁,保护细胞免受病原菌的侵染。近年来，突变体及通过转基因植物对木质素生物合成调控的研究主要表现 在3个层次 一是苯丙氨酸途径上的调控，涉及3种酶PAL (phenylalanine ammonia陽lyase) 、 C4H(cinnamate 4-hydroxylase)禾口 4-CL(4陽coumarate:CoA ligase)， 它们的表达决定木质素总量；二是木质素特异合成途径上的调控，主要集中于3 种酶，艮卩C0MT (caffeic acid O-methyltransferase) 、 CCoA0MT (caffeoyl-CoA O-methyltransferase)和F5H (ferulate 5-hydroxylase)，这些酶类的表达对木质素 含量尤其木质素单体的特异合成影响较大，决定了各种单体在木质素总量中的比 例；三是对木质素特异合成途径下游酶类的调控，包括两种还原酶CAD(cinnamyl alcohol dehydrogenase)和CCR (cinnamoyl-Co A reductase)， 它们负责将各禾中轻 基肉桂酰-辅酶A(CoA)酯最终还原成各种木质素单体。苯丙氨酸途径是植物三大次生代谢途径之一。植物的许多重要次生代谢产 物均由该途径而来。如木质素、类黄酮、花青素、植保素、酚类物质、信号分子等。该途径由PAL、 C4H、 4-CL三个酶组成，其中4-CL负责催化肉桂酸及其衍生 物生成相应的辅酶A酯，活化后的底物再进入各种不同的代谢途径，参与各种下 游次生产物的合成。由于4-CL在苯丙氨酸途径中处于代谢分支点的位置，是木质素单体合成途 径中的关键酶，因此被认为是调控木质素合成的理想耙基因。目前有关4-CL调 控的研究大多是通过反义RNA技术降低植物内源4-CL活性水平，从而达到降低 木质素含量，提高林木的造纸品质和牧草的饲用价值，而利用4-CL的过量表达 以提高植物木质素含量、增强植物抵抗逆境能力方面的研究则未见报导。虽然目前从各种植物中分离到的编码4-CL蛋白的基因或cDNA很多，但在 本专利技术申请之前，国内没有人公开或发表过毛白杨木质素单体合成基因4-CL 基因序列及其在甘蓝型油菜中的用途。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种毛白杨木质素单体合成基因4-CL。该基 因是调控木质素总量合成的关键基因，负责催化各种肉桂酸及其衍生物生成 相应的辅酶A酉旨，参与各种下游次生产物的合成，进而提高木质素总量，增 强植物抵抗病原物的侵染。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种毛白杨木质素单体合成基因4-CL 在油菜抗菌核病中的应用。本专利技术的再一个目的是在于提供了一种毛白杨木质素单体合成基因4-CL在 油菜抗倒伏中的应用为了实现上述任务，本专利技术采用以下技术措施毛白杨木质素单体合成基 因4-CL的获得1) 在NCBI数据库中检索已发表的杨树4-CL基因序列，用01igo6. 0软件(通 过商业途径市场购买获得，下同)设计基因编码序列的两侧引物(正向引物 ; 反 向 弓l 物 )。2) 以cDNA第一链为模板进行RT-PCR扩增，将扩增得到的片段进行测序， 获得4-CL基因序列， 一种DNA分子，其碱基序列如SEQ IDN0:1所示。通过上述方法获得了毛白杨木质素单体合成基因4-CL，采用一种提高 4-CL基因表达活性的转基因油菜，其特征在于转基因植物表现为木质素含量增 加，比受体对照(非转基因植株)木质素含量增加10%以上，抗菌核病和抗倒伏能力提高，转基因植株比受体对照(非转基因植株)病斑扩展面积变小30%左右， 茎杆强度则比对照(非转基因植株)增强在20%左右。在本专利技术中为了达到上述目的采用以下技术方法，提供了一种质粒表达载体pBI121 (从商业途径获得，下同)，它含有特异表达启动子(木质部特异 表达的C4H启动子)和翻译控制件。在本专利技术的另一个方面，提供了一种可在植物中表达的宿主菌，本专利技术优 选的是农杆菌，更优选的是根癌农杆菌LBA4404 (从商业途径获得，中国科学院 遗传与发育研究所购置，下同)。本专利技术也提供了一种将所述载体导入植物细胞 的方法，如基因枪注射法，细菌导入法。本专利技术优选农杆菌导入法，如农杆菌 LBA4404油菜子叶柄导入法。本专利技术提供了一种能够过量表达毛白杨4一CL基因的转基因油菜的方法， 其特征在于油菜木质素含量增加，抗菌核病和抗倒伏能力增强。该方法包括下列 步骤1) 将克隆得到的毛白杨木质素单体合成基因4一CL连接到质粒pBI121上， 利用木质部特异表达的C4H启动子形成可转化或表达的载体(pBI121-C4H:4CL);2) 将步骤1)中制备的载体(pBI121-C4H:4CL)转入根癌农杆菌LBA4404，再 导入甘蓝型油菜植株中；3) 筛选阳性植株。在本专利技术中，①以中国特有树种毛白杨，根据已发表的杨树4一CL基因 的保守序列，在基因编码序列的两侧保守区域设计特异引物进行RT-PCR扩增， 得到了基因序列如SEQ ID N0:1所示。用HindlII/BamHI分别双酶切C4H启动 子PCR产物和PBI121质粒，将PCR酶切片段和PBI121质粒酶切大片段连接后， 转化到感受态细胞DH5ct (从商业途径获得)中扩增，然后再将4-CL基因引入 到载体PBI121中，并取代PBI121中原有的GUS序列，而载体中的35S启动子序 列则被C4H启动子序列所取代，构建植物表达载体重新命名为pBI-C4H:4,tCL。 ②袼含有4-CL基因的载体转染根癌农杆菌LBA4404，培养农杆菌于YEP液体培 养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，氯化钠5g)，并将无菌苗在农杆菌菌液 中浸泡。③在加卡那(Kan)的选择培养基筛选阳性克隆。在本专利技术的一个具体实施例中，植株无菌苗选自油菜，通过选择培养基最 后筛选到油菜木质素单体合成基因4-CL表达的植株，植株表现出木质素含量增 加10%以上，抗倒伏能力和抗菌核病分别提高20%和30%左右。本专利技术中所用的术语"转基因植物"是指含有导入的基因并能够稳定地增强或抑制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。本专利技术中的"植物细胞"是指植物的各种未成熟胚，愈伤组织或悬浮细胞 (成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶)，或原生质体(叶肉细 胞)。这些植物细胞在适当的条件下均能再生成植物。克隆本专利技术中所述的毛白杨木质素单体合成基因4-CL的方法是本领域中所 常采用的方法。提取raRNA的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ分子，其碱基序列如ＳＥＱＩＤＮＯ：１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王汉中，杨向东，刘贵华，王新发，华玮，刘静，杨庆，郑元本，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]