本发明专利技术公开了一种固定化双菌串联法由葡萄糖发酵生产１，３－丙二醇的方法。第一步，利用生物微胶囊包埋产甘油的假丝酵母菌Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ，然后放在生物反应器中培养，从而将葡萄糖转化为甘油；第二步，利用生物微胶囊包埋产１，３－丙二醇的克雷伯杆菌Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，将前一步的产物甘油在生物反应器中进一步转化为１，３－丙二醇。本发明专利技术可以省去中间较复杂的甘油分离过程。实现了生物法将葡萄糖转化为１，３－丙二醇，工艺过程简单，细胞便于重复利用，实现连续操作；本发明专利技术的特色在于通过细胞固定化和两种反应器的合理组合实现了多细胞反应与转化过程的集成，同时可部分消除底物抑制，易于消除副产物和产物抑制，简化了１，３－丙二醇从发酵液中的分离。
【技术实现步骤摘要】
,3－丙二醇的方法
本专利技术涉及一种，3-丙二醇的方法。
技术介绍
1，3-丙二醇是重要的溶剂和化工原料，以其作为单体可以用来合成性能优良的聚酯、聚氨酯等缩聚物。近来，由于以1，3-丙二醇和对苯二甲酸为单体合成的聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)具有非常独特的性质，受到著名的大型化学工业公司的重视。1995年，荷兰壳牌(Shell)化学公司首先实现PTT商品化(商品名Corterra)，并开发了化学法生产1，3-丙二醇的新工艺路线。到1999年，年产72,000吨的装置已经投入运营。随后德国Degussa也完成了年产10,000吨的装置设计。1998年，美国杜邦(DuPont)公司获得了Degussa公司的化学法生产技术，但是杜邦的研究重点在于生物转化法生产1，3-丙二醇，并与世界第二大工业酶生产商Genencor公司联合申请了以葡萄糖为底物用基因工程菌直接生产1，3-丙二醇的专利。目前我国1，3-丙二醇的产量非常低，大量工业用1，3-丙二醇仍需进口，随着PTT的研制开发，1，3-丙二醇的需求量将会不断增加，因而开发1，3-丙二醇的生产工艺有着非常重要的现实意义。由甘油生产1，3-丙二醇已经成为比较成熟的生产方法，但是考虑到市场上原料甘油的供求情况，以及丰富的葡萄糖资源，目前许多研究者都转而关注由葡萄糖直接转化生产1，3-丙二醇的工艺。因为葡萄糖除了可以从粮食获取外，自然界中广泛存在的植物纤维类物质，经过酸水解或酶解都能得到，而生物可再生资源的利用符合可持续发展和绿色化工的趋势。目前自然界中尚未发现能直接将葡萄糖转化为1，3-丙二醇的微生物，生物法转化葡萄糖生产1，3-丙二醇的代表性工艺路线有二条一是通过基因工程的手段，将产甘油的关键酶基因克隆到产1，3-丙二醇的微生物中，或者将产1，3-丙二醇的关键酶基因克隆到产甘油的微生物中；二是通过双菌发酵，先将葡萄糖转化为甘油，再将甘油转化为1，3-丙二醇。其中双菌发酵包括二步法和混菌发酵的工艺。二步法中，第一步产生的甘油要经过较复杂的分离过程，才能作为第二步的原料，生产过程比较复杂，运行成本也相对较高，不利于连续操作。在混菌发酵时，由于不同微生物间的相互作用和影响，往往稳定性不好、调控困难，难于同时达到不同微生物的最适生长条件。因此认为第一种方法的可行性较大，而第二种混菌培养方法研究得较少。但是在二步法由葡萄糖转化为1，3-丙二醇的过程中，甘油需要从第一步发酵液中分离出来，存在着工艺过程复杂和操作成本偏高的问题，且不利于连续化生产。文献报导，在游离发酵Klebsiella pneumoniae时，初始甘油浓度提高到84.47g/L时，底物甘油就会对发酵过程产生较强的抑制作用，转化率和生产强度就分别降至0.15mol/mol，1.04gL-1h-1。由于生产过程中所采用的两个菌种都是普通的工业用微生物，在菌种的获取和利用上没有很大限制，因此目前不少生产工艺基本都采用双菌发酵过程。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，3-丙二醇的方法。它包括如下步骤1)在无菌水中加入40～100ml的Candida krusei种子培养液，将种子培养液稀释到原浓度的1/6～1/3，取100ml稀释后的种子液与3～8g聚合物阴离子混合，搅拌均匀，得到含有Candida krusei的聚合物阴离子溶液；2)将步骤1)含有Candida krusei的聚合物阴离子溶液脱气后，通过气流微囊发生器滴入浓度为1～8％(w/v)的聚合物阳离子溶液中，室温下搅拌反应20～50分钟后，洗去表面残余的聚合物阳离子，得到待培养的微胶囊包埋有Candida krusei的细胞；3)将150～200ml上述微胶囊加入到含300～500ml发酵培养基的反应器中，通入无菌压缩空气，流速为0.2～0.4vvm，反应温度为30～40℃，经过76～120小时的培养，得到甘油发酵液。4)在无菌水中加入40～100ml的Klebsiella pneumoniae种子培养液，将种子培养液稀释到原浓度的1/6～1/3，取100ml稀释后的种子液与3～8g聚合物阴离子混合，搅拌均匀，得到含有Klebsiella pneumoniae的聚合物阴离子溶液；5)将步骤4)含有Klebsiella pneumoniae的聚合物阴离子溶液脱气后，通过气流微囊发生器滴入浓度为1～8％(w/v)的聚合物阳离子溶液中，室温下反应20～50分钟后，洗去表面残余的聚合物阳离子，得到待培养的微胶囊包埋有Klebsiella pneumoniae的细胞；6)将400ml步骤5)包埋有Klebsiella pneumoniae细胞的微胶囊加入到反应器中，反应器温度为30～40℃，将步骤3)的甘油发酵液加入固定床反应器，同时补充微量元素，经过5～20小时的培养，得到1，3-丙二醇发酵液。所述的聚合物阴离子为纤维素硫酸钠或海藻酸钠。聚合物阳离子为聚二甲基二烯丙基氯化铵或氯化钙。每升微量元素溶液包含0.5～0.8g ZnCl2、2.0～4.0gMnCl2·4H2O、60～80mg H3BO3、0.4～0.6g CoCl2·6H2O、5～10mg NaMoO4·2H2O、0.1～0.3gCuCl2·2H2O、5～8g FeCl3·6H2O、10～20mL浓度为37％的HCl。反应器为搅拌式生物反应器、气升式生物反应器或固定床生物反应器中的一种或多种。本专利技术的有益效果1)本专利技术实现了由葡萄糖到1，3-丙二醇的转化；2)利用微胶囊包埋Candida krusei产甘油和包埋Klebsiella pneumoniae产1，3-丙二醇，便于细胞的重复利用，大大缩短发酵时间；3)利用微胶囊包埋Klebsiella pneumoniae产1，3-丙二醇可以消除底物抑制作用；4)通过分别固定化双菌再进行串联发酵，可以省去甘油分离过程的中间步骤，直接利用第一步得到的胶囊外发酵液进行第二步发酵生成1，3-丙二醇；5)本专利技术工艺简单，操作方便，具有生物反应的集成化功能，易于推广，对于双菌发酵具有较好的普遍实用性。具体实施例方式本专利技术通过用微胶囊包埋从葡萄糖产甘油的假丝酵母菌Candida krusei和包埋从甘油产1，3-丙二醇的克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae，分别置于两个生物反应器中。串联二个生物反应器实现由葡萄糖到1，3-丙二醇的转化工艺。利用微胶囊固定化细胞的特性，通过分别固定化以上两种菌体再进行串联发酵，也即固定化产甘油假丝酵母菌Candida krusei从葡萄糖发酵生产甘油，固定化克雷伯氏杆菌Klebsiella pneumoniae从甘油发酵生产1，3-丙二醇，然后将二个过程串联起来，形成直接由葡萄糖进料，生产目标产物1，3-丙二醇的新的发酵生产工艺。通过适当的工艺条件控制，可以实现无需中间复杂的分离过程即可由葡糖糖直接生产1，3-丙二醇。实施例中使用菌株分别为Candida krusei(ACCC 2197)和Klebsiella pneumonia(CMCC(B)46112)，购自于中国科学院微生物研究所。实施例1首先在无菌水中加入40ml的Candida krusei种子培养液，将种子培养液稀释到原浓度的1/6。取100ml稀释本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固定化双菌串联法由葡萄糖发酵生产１，３－丙二醇的方法，其特征在于，它包括如下步骤：１）在无菌水中加入４０～１００ｍｌ的Ｃａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉ种子培养液，将种子培养液稀释到原浓度的１／６～１／３，取１００ｍｌ稀释后的种子液 与３～８ｇ聚合物阴离子混合，搅拌均匀，得到含有Ｃａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉ的聚合物阴离子溶液；２）将步骤１）含有Ｃａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉ的聚合物阴离子溶液脱气后，通过气流微囊发生器滴入浓度为１～８％（ｗ／ｖ）的聚合物阳离子溶 液中，室温下搅拌反应２０～５０分钟后，洗去表面残余的聚合物阳离子，得到待培养的微胶囊包埋有Ｃａｎｄｉｄａｋｒｕｓｅｉ的细胞；３）将１５０～２００ｍｌ上述细胞加入到含３００～５００ｍｌ发酵培养基的反应器中，通入无菌压缩空气，流速为 ０．２～０．４ｖｖｍ，反应温度为３０～４０℃，经过７６～１２０小时的培养，得到甘油发酵液。４）在无菌水中加入４０～１００ｍｌ的Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ种子培养液，将种子培养液稀释到原浓度的１／６～１／３，取１００ ｍｌ稀释后的种子液与３～８ｇ聚合物阴离子混合，搅拌均匀，得到含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ的聚合物阴离子溶液；５）将步骤４）含有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ的聚合物阴离子溶液脱气后，通过气流微囊发生 器滴入浓度为１～８％（ｗ／ｖ）的聚合物阳离子溶液中，室温下反应２０～５０分钟后，洗去表面残余的聚合物阳离子，得到待培养的微胶囊包埋有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ的细胞；６）将４００ｍｌ步骤５）包埋有Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌ ａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ细胞加入到反应器中，反应器温度为３０～４０℃，将步骤３）的甘油发酵液加入反应器中，同时补充微量元素，经过５～２０小时的培养，得到１，３－丙二醇发酵液。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚善泾，陈国，关怡新，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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