【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组DNA技术。一方面，本专利技术涉及甲醇诱导的调节区，另一方面，本项专利技术涉及葡萄糖存在的条件下被阻遇了的调节区域。还有一方面，本专利技术涉及整合了本专利技术的调节区的新型表达载体，以及由此产生的新型转化体和受调节的多肽的表达。近年来，由于重组DNA技术的发展，所以就使得控制由微生物产生的各种有用多肽成为可能。许多真核多肽如人生长激素、白细胞干扰素、人胰岛素、人胰岛素原等等已由多种微生物产生。人们期待将来重组DNA技术能有进一步的发展，以便得到更加有效的方法来利用微生物生产有用的多肽产品。一项吸引人的发展将是调节区域的分离和鉴定，该调节区域可以通过选择适当的培养基、生长条件或其它条件而很容易地打开和关闭。例如，Ellis、Brust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras就曾在1985年5月的《分子及细胞生物学》出版物(1111-1121页)上揭示了DNA序列的分离和特性鉴定，该序列与甲醇的存在相应答，并且在某些分解代谢抑制碳源如葡萄糖存在的条件下，该序列受到分解代谢产物阻遏。本专利技术是在对上述的参考资料进行进一步的研究后得出...
【技术保护点】
一种与培养基中的甲醇的存在相应答的ＤＮＡ片段，这种培养基是用于带有该片段的宿主所生长的；其中所说的片段是作为一种自主成分存在于所述宿主中；且所说片段至少由下列核苷酸序列及其功能等价物组成：５↑〔１〕－ＧＣＴＡＣＴＡＡＣＡ，ＣＣＡＴＧＡＣ ＴＴＴ，ＡＴＴＡＧＣＣＴＧＴ，ＣＴＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＧ，ＡＧＧＴＣＡＴＧＴＴ，ＴＧＴＴＴＡＴＴＴＣ，ＣＧＡＡＴＧＣＡＡＣＡＡＧＣＴＣＣＧＣＡ，ＴＴＡＣＡＣＣＣＧＡ，ＡＣＡＴＣＡＣＴＣＣ，ＡＧＡＴＧＡＧＧＧＣＴＴＴ ＣＴＧＡＧＴＧ，ＴＧＧＧＧＴＣＡＡＡ，ＴＡＧＴＴＴＣＡＴＧ，ＴＴＣＣＣＡＡＡＴＧＧＣ...
【技术特征摘要】
US 1986-3-14 839845书中明显可见。本发明人已惊奇地发现由Ellis、Brust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras(Molecular and Cellular Biology，1985年5月，1111-1121页)等所公布的调节区的独特亚片段具有独特的调节性质;一个这样的调节区当作为染色体成分引进宿主体内时，在甲醇存在的条件下能够完全诱导;另一个这样的调节区当作为染色体外成分引进宿主体内时，甲醇能够对其进行完全诱导;还有另一个这样的调节区能够为定位在下游的异源启动子核苷酸序列提供这样一种能力，即在甲醇存在的条件下被诱导而在分解代谢产物抑制碳源存在的条件下被阻遏。图1是毕赤酵母属的伯醇氧化酶基因(AOXI)的5′区的限制性酶切图谱。图2是质粒pSAOH5的限制性酶切图谱。图3是在pBR322基础之上构建的质粒pPG2.5的酵母插入子的限制性酶切图谱。图4是质粒pBPf3I的限制性酶切图谱。图5是实例中的讨论的构建载体的流程图。下面的缩写是用在图中以代表所用的限制性内切酶。缩写 限制酶A AvaⅡB BamHⅠB2BglⅡBc BclⅠH2HincⅡH3HindⅢK KpnⅡNd1NdeⅠNr NruⅠPs PstⅠPv2PvuⅡR1EcoRⅠR5EcoRVS SalⅠSm SmaⅠSs SstⅠSt StuⅠ附图中，用于DNA片段的操作的限制性酶切位点用圆括号将破坏位点的缩写圈起来表示，不过这些点在连接时被破坏。本发明提供了一种新型DNA片段，它包括与培养基中的甲醇的存在相应答的调节区，该培养基是与该DNA片段的宿主体相联系的。当将本发明的一新型片段作为单拷贝整合进宿主体的基因组(即作为染色体成分而不是作为染色体外成分被携带)时，它能够在甲醇存在的条件下促进完全诱导。当作为宿主体的染色体外成分(即在宿主体内作为自主成分维持)或作为染色体成分时，本发明的另一新型片段在甲醇存在的情况下能够促进完全诱导。当本发明的DNA片段的调节区位于编码产生mRNA的DNA的5′末端时，它能够控制mRNA的转录。上述DNA片段的突变型和功能等价物也包括在本发明的范围之内。“完全诱导”一词用在本发明书中是指所给DNA片段与甲醇的存在相应答的能力。该词涉及甲醇与调节区相应答以诱导产生蛋白质产物的水平的能力，该水平与使用同相调节区一结构基因构造物转化的宿主的野生型AOXI蛋白质编码序列上游的1Kb非编码序列新达到的水平相当。本发明进一步提供了一种由上游激活剂序列组成的DNA片段，它赋予位于下游的异源启动子核苷酸序列这样一种能力，即在该DNA片段的宿主体所在的培养基中含有甲醇时，能够诱导其表达，而在含有分解代谢产物抑制碳源时，能够抑制表达。当将本发明的这一实施方案中的DNA片段的调节区与位于编码mRNA的5′末端的异源启动子相结合时，它能够控制mRNA的转录。上述DNA片段突变型和功能等价物也包括在本发明的范围之内。按照本发明，还可进一步提供质粒和含有上述DNA片段的转化体，以及使用这种转化体生产多肽的工序。在本发明的另一实例方案中，还提供了一种通过使用可变数量的可操作调节区的核苷酸来控制调节区对于甲醇的应答的方法。能够获得的甲醇应答范围从微小应答(只有“完全”诱导的百分之几)直至完全甲醇诱导均可达到。本发明的调节区对于使用重组DNA修饰的宿主用以调节多肽的生产是非常有用的。例如，在本发明的一个实施方案中，从整合表达盒中甲醇诱导多肽产物的表达是可能的。在另一实施方案中，从自主表达盒中甲醇诱导多肽产物的表达也是可能的。按照本发明的另一个实施例，多肽产物的表达受转化宿主控制，而该宿主带有一种多肽编码序列，这一序列在甲醇诱导和分解代谢产物抑制条件相应答的上游激活剂序列的控制之下;并且此后在甲醇或分解代谢产物抑制碳源存在或缺乏的条件下使转化宿主得以维持。这样，按照这一具体实施方案，如果需要某一特定水平的多肽产物，就可以对培养基的组成进行调整，直至达到所需水平的多肽产物，然后通过向培养基中加入一种分解代谢产物抑制碳源以阻止多肽编码序列的进一步表达。按照这后一种实施方案，本发明的上游激活剂序列对于在正常的非调节启动子的控制条件下完成多肽产物的调节生产是有用的。例如，通过掺入本发明的上游激活剂序列，可以使得组成启动子对甲醇诱导和分解代谢产物抑制作出反应。按这种方式，任何能够作为RNA转录的一个启动子的功能序列的表达都可以通过有无甲醇或分解代谢产物抑制碳源而受到控制。将从Ellis、rust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras所揭示的伯醇氧化酶基因(AOX;见图1)(Molecular and Cellalor Biology，1985年5月，1111-1121页)的5′端得到的大约1kb的调节区分别从3′末端和5′末端进行BAL31消化，然后将产生的突变启动子片段与大肠杆菌LacZ基因融合，得到一系列载体。5′端的缺失产生了下列载体表1载体 AO启动子 缺失区域pSAOH5 -900→ATG nonepBAZ3 -709→ATG 5′191bppBAZ4 -499→ATG 5′401bppBAZ6 -372→ATG 5′528bppBAZ7 -216→ATG 5′684bppBAZ8 -197→ATG 5′703bp载体pSAOH5(见图2)代表完整的5′-乙醇氧化酶调节区，而载体pBAZ3，4，6，7和8则代表5′端缺失。将这些含有各种调节区一结构基因(lacZ)构建物的载体转化一种巴斯德毕赤酵母营养突变体，然后当其在作为碳源和能源的甲醇或葡萄糖上生长时，检测β-半乳糖苷酶的产生。而β-半乳糖苷酶表达结果的详细分析见实施例，其结果总结如下(a)在ATG起始密码子上游的709碱基对与499碱基对之间存在一个弱的甲醇应答区，该密码子是用于含有这些序列的自主载体的，而整合载体的完全甲醇应答不需要上游709至499碱基对的序列。因此，尽管对于整合和自主载体来说，具有0-709核苷酸序列得到了完全用醇诱导，而带有乙醇氧化酶ATG上游的0-499碱基对，则自主载体仅显示约为50%的甲醇诱导。由自主载体表达的完全诱导所需要的709个碱基对序列如下所示序列A5′-GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGCCCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAACAAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGCTTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATGGCCCAAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAATATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTGGTTCGTTGAA ATGCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAACTTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGATTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAACTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGAAGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCATTATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGACAAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAAGATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3′.带有象ATG上游的第一个197个这样少的核苷酸至少观察到微小的甲醇诱导。(b)在起始密码子ATG上游的约372和197碱基对之间存在一个强的甲醇应答区。而在起始密码子ATG上游的372和216碱基对之间存在一个葡萄糖应答区。通过附加实验(其详性见实施例)，已表明这一片段具有一上游激活剂序列(UAS)的性质，即它可赋予下游异源启动子序列具有通过甲醇的存在而被诱导和/或通过一种分解代谢产物抑制碳源如葡萄糖的存在而被抑制。这种UAS片段的序列如下序列B5′-ATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAA-3′从5′-AOXI启动子的3′末端制备一系列缺失，然后依次克隆进5′缺失载体pBAZ6和pBAZ8中，得到的载体序列列于表Ⅱ表Ⅱ载体 缺失pBAZ801 -264→197pBAZ802 -347→197pBAZ803 -445→197pBAZ805 -532→197pBAZ804 -694→197pBAZ604 -445→372pBAZ601 -532→372pBAZ603 -542→372pBAZ602 -694→372表Ⅱ中所列的一套载体在与AOXI的ATG起始密码子相关的694和197碱基位置之间含有可变的内部缺失。总结于表Ⅱ的载体所含有的启动子序列的5′部分是从乙醇氧化酶调节区的3′末端缺失得到的，而总结于表Ⅱ的载体所含有的调节区的3′部分是从乙醇氧化酶调节区、pBAZ6和pBAZ8的5′末端缺失得到的。如同前面一样，用这种调节区-β-半乳糖苷酶结构基因构建物集合转化一种巴斯德毕赤酵母营养突变株，然后，当其在甲醇或葡萄糖上生长时，以检测β-半乳糖苷酶的产生。检测结果的详细分析见实施例，其结果可概括如下在ATG起始密码子上游的约260至370核苷酸之间的大约100个碱基对区域内存在一个非常强的甲醇可诱导成分。另外，在ATG起始密码子上游的约500至700核苷酸盐区域也发现了一个较弱的甲醇可调节DNA片段。而且，在乙醇氧化酶ATG起始密码子上游的从约350至375碱基对区域观察到了一个葡萄糖可抑制区。这一葡萄糖可抑制区正好在甲醇可诱导区上游，且可能与甲醇应答序列相重叠。上述所鉴定的任一甲醇可诱导成分都可以单独或以重组形式插入表达载体之中，而使甲醇诱导的基因能够表达。相反地，上面所鉴定的葡萄糖可抑制区可以从甲醇可诱导的启动子成分中删掉，这样，当将经修饰的启动子用于表达载体且产生的转化体在葡萄糖存在的条件下生长时，就使得非抑制基因能够表达。或者，可以将葡萄糖可抑制区特意包括在特殊设计的载体中，以便能够迅速地控制基因表达的“开-关”。按照本发明的另一个实施方案，本发明提供了一种控制被整合了的调节区的应答的方法，它是在甲醇存在的条件下通过利用一种含有可变数目的碱基对的核苷酸序列作为调节区而完成的。这样，当使用最小值为下列197个碱基对时，得到了完全甲醇诱导的5%。序列C5′-AAATTTAACTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGAAGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCATTATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGACAAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAAGATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3′.当所有下列增加序列都被使用时，对于被整合的表达载体观察到了基本上完全的甲醇诱导序列D5′-ATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAA-3′甲醇诱导的近似程度与在被整合表达载体中所使用的调节区的大小的关系列于表Ⅲ表Ⅲ核苷酸序列 甲醇诱导(%)0-197 50-197加347-372 50-197加264-372 250-372 100与此相似，本发明也提供了一种控制自主调节区对于甲醇的存在进行应答的方法，它是通过使用至少含有上述序列C中所列的197个核苷酸的一段核苷酸序列作为调节区而完成的。如果要达到完全甲醇表达还需要下列补加序列序列E5′-GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGCCCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAACAAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGCTTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATGGCCCAAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAATATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTGGTTCGTTGAA ATGCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAACTTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGATTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGCAGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCGAAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTATGCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGGGAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAA-3′.甲醇诱导的近似程度与调节区的大小的关系见表Ⅳ表Ⅳ核苷酸序列 甲醇诱导(%)0-197 40-216 130-372 500-499 500-709 100按照本发明的一个实施方案，将序列B所示的上游激活剂序列(UAS)插入到通常对于葡萄糖和/或甲醇的存在不敏感的毕赤酵母序列的上游。当其生长在葡萄糖上时，含有UAS的转化体的基因产物(β-半乳糖苷酶)的表达被抑制要比不含UAS的构建物，pBPf3I大400倍以上。生长于甲醇上时这一抑制减弱;β-半乳糖苷酶的产生水平要比在葡萄糖上转化体的那些增加170倍以上。表ⅤpBPf-3Ⅰ中的插入子 生长于甲醇与葡萄糖上时产生的β-半乳糖苷酶的比值无 1.07-197至-372 174具体的转化株，结果等在实施例中有详细叙述。根据以下非限定实例，现在对本发明进行更详细地叙述。实例下面的实例中所用的缓冲液和溶液的组成如下SD平皿 2%琼脂6.7不含氨基酸的酵母含氮碱基(DIFCO)重量百分比为2的葡萄糖溶于1升水中YNB肉汁培养基 6.7克不含氨基酸的酵母含氮碱基(DIFCO)溶于1升水中Z缓冲液 0.1M磷酸钠，pH7.00.01M Kcl0.001M Mg SO40.039M β-巯基乙醇X-gal 指示剂平皿 2%琼脂0.5%(体积)的甲醇6.7克不含氨基酸的酵母含氮碱基(DIFCO)0.4毫克生物素40毫克X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)溶于1升水中，用磷酸二氢钾(monobasic potassium phosphate将pH调至7-EGTA＝乙二醇-双-(β-氨基乙基醚)-N，N，N′，N′-四-乙酸(Sigma公司)在下面的实施例中所用到的菌株可以从被承认的保藏单位得到，登记号如下-细菌菌株JM103，HB101和MC1061通常均可得到-毕赤酵母GS115＝NRRL Y-15851-pSAOH5(转化到GS115＝NRRL Y-15853;转化到大肠杆菌＝NRRL B-15862)-pBPf3Ⅰ是从质粒pBPf1得到的(登记号为NRRL B-15892)，它用到了下列各步序列将从pYJ8(登记号NRRL B-15889)得到的0.6kbp的EcoRⅠ-PvuⅡ片段(该片段含有毕赤酵母HIS4启动子序列)插进pBPf1的EcoRⅠ-SmaⅠ位点。所合成的质粒被称为pBPf3。用PstⅠ和NruⅠ降解质粒pBPf3以释放出含有lacZ序列的片段。将该片段与pYM4的PstⅠ-EcoRV片段连接，以产生质粒pBPf3Ⅰ，其中pYM4含有插入到pBP322的BamHⅠ位点的pYJ8的BglⅡ片段，而BglⅡ片段又含有HIS4，见图4所示。-pPG2.5(可从等于NRRL B-15868的pPG4.0得到，详情见下)实例1AOXI启动子的5′-末端缺失的构建用EcoRⅠ将30毫克质粒pSAOH5(图2)完全降解，苯酚抽提，及乙醇沉淀。将得到的干DNA沉淀溶于水(最终反应体积＝100微升)，然后于23℃用1.2单位的BAL31降解。每隔3分钟，取10微升到10微升40m MEGTA中，然后用苯酚抽提及乙醇沉淀。从每一部分得到的重新溶解的DNA沉淀用1单位的Klenow DNA多聚酶进行处理以增强平末端，然后连接到EcoRⅠ连接子(5′-GGAATTCC-3′)上，再用PstⅠ和EcoRⅠ完全降解以释放大约9.0kbp的载体片段。然后将PstⅠ-EcoRⅠ所降解的DNA连接到来自pBR2的750bp的PstⅠ-EcoRⅠ片段上，以便再次生出β-内酰胺酶基因。将连接的DNA转化进JM103，筛选出氨苄青霉素抗性的转化株。挑选从每一BAL31降解的pSAOH5的等分试样得到的并且在x-gal指示剂平皿上检测对β-半乳糖苷酶阳性的单个转化株，用微量DNA制备方法检测在AOXI启动子中含有新的EcoRⅠ限制性位点的质粒的存在。用EcoRⅠ和EcoRV进行完全降解(见图2)就能够鉴定含有融合进大肠杆菌lac Z基因中的各种长度的AOXI启动子的克隆。这些克隆的名称如下表1载体 AO启动子 缺失区pSAOH5 -900→ATG nonepBAZ3 -709→ATG 5′191bppBAZ4 -499→ATG 5′401bppBAZ6 -372→ATG 5′528bppBAZ7 -216→ATG 5′684bppBAZ8 -197→ATG 5′703bp然后按照公布过的方法(Cregg等，Molecular and Cellular Biology 5，3376-3385(1985))，用含有这些缩短了的AOXI启动子序列的质粒转化巴斯毕赤酵母菌株GS115，筛选出Hi S表型的转化株。使Hi S转化株生长于各种碳源上，并且检测β-半乳糖苷酶的产生(见表Ⅵ)。表Ⅵβ-半乳糖苷酶，单位/OD600自主载体载体 缺失 生长于葡萄糖 生长于甲醇pSAOH5 None 1 1000pBAZ3 5′(191bp) 1 1000pBAZ4 5′(401bp) 1 500pBAZ6 5′(528bp) 1 500pBAZ7 5′(684bp) 15 150pBAZ8 5′(703bp) 15 40基于该项说明，即pBAz6含有甲醇可诱导的-葡萄糖可抑制的序列的大部分，而pBAz8大都缺失了这些应答区，选择质粒pBAz6和pBAz8用于进一步的研究。实例ⅡAOXI启动子的3′-末端缺失的构建用BamHⅠ将18毫克的质粒pPG2.5(在pBR322基础上构建的质粒，它含有pPG4.0的大约2.5kbp的EcoRⅠ-SalⅠ片段，如图3所示)完全降解苯酚抽提及乙醇沉淀。用1.2单位的BAL31在23℃下消化溶解的DNA沉淀(最终反应体积＝100μl)，每隔3分钟取10微升的等分试样到10微升40mM EGTA中，然后用苯酚抽提和乙醇沉淀。用1个单位的Klenow DNA多聚酶处理重新溶解的每一等分试样中的DNA沉淀，增强平末端，连接到EcoRⅠ连接子上，用来转化氨苄基青霉素抗性大肠杆菌HB101菌株，从每-BAL31降解的pPG2.5的等分试样挑选出单个转化株，用微DNA制备方法检测在AOXI启动子中含有新的EcoRⅠ限制性酶切位点的质粒的存在。分离出在AOXI的启动子中的AOXIATG上游的264，347，445，532，542和694核苷酸位置含有新的EcoRⅠ限制性酶切位点的质粒，且分别定名为pPG2.5△4，△5，△7，△10，△12和△11，然后用EcoRⅠ降解。这些降解分别产生出大约1186，1103，1005，918，908和756个碱基对的新的EcoRⅠ片段。分离并乙醇沉淀所形成的EcoRⅠ片段，该片段含有后来插到BAL31诱变中并定位在EcoRⅠ连接子上游的AOXI启动子的部分。实例Ⅲ用lacz融合质粒转化的毕赤酵母的生长挑选一个转化菌落，划线接种于SD平皿。将通过划线得到的一个单菌落接种于50毫升的摇瓶中，其中含有15毫升YNB肉汁培养基和2%...
【专利技术属性】
技术研发人员：理查德哥尔登布克霍尔茨，
申请(专利权)人：菲利普石油公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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