植物细胞中基因表达的反向调节制造技术

通过整个一个处于启动子之转录控制下的基因，以达到对编码植物细胞基因组中之基因的表达控制，所说的启动子是在宿主中有功能活性的，并且其中ＤＮＡ的被转录链与来自期望调节之内源基因的被转录的ＤＮＡ链互补．已整合之基因提供了一段能结合于天然存在的ＲＮＡ并抑制其表达的ＲＮＡ序列，此时反向序列可结合于ＲＮＡ的编码部分、非编码部分或编码与非编码两部分．可以多种方式将反向结构引入植物细胞内并整合到植物基因组中，以使此反向结构得以进行诱导下的或固有的转录．（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
用遗传工程来改良植物已落后于分子生物学对单细胞微生物和哺乳动物细胞的了解和利用。用外来DNA对单细胞微生物或哺乳动物细胞进行稳定的转化已被证实为有效的技术，但尚未发现其对植物细胞也同样有效。因此，尽管涉及到单细胞微生物和哺乳动物细胞方面的工作已取得不少成就，但涉及植物细胞的成功却很少，而且研究其它类型生物体的成功经验也尚未付诸于研究植物细胞的实践。在许多情况下，往往希望改良植物细胞的某一个现有的品质，而不是引入某一新的品质。为此，也可能希望改变某一种特定酶的活性，使某一个等位基因与其它相比更易于表达，如使某种同功酶与其它相比更易表达等等。许多情况下都只是希望降低结构基因的表达量，而不是抑制其完整表达。因此特别期望发展可允许直接改变特定植物细胞、植物组织或植物之表型的技术Crowley等〔Cell(1985)43633-641〕叙述了小盘基因(discoidin gene)的反向(anti-sense)结构，当将它转染到网柱菌属(Dictyostelium)去时可抑制内源性小盘基因的表达(也可参见在该文中所引用的文献)。Rcsenberg等〔Nature(1985)313703-706〕，Preiss等〔Nature(1985)31327-32〕，Melton〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82144-148〕，Izant和Weintraub〔Science(1985)229345-352〕以及Kim和Wold〔Cell(1985)42129-138〕也记叙了反向调节。另外还可参见Izant和Weintraub〔Cell(1984)361007-1015〕;Pestka等〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)817525-7528〕;Mizuno等〔杂志同上(1984)811966-1970〕;Coleman等〔Cell(1984)37683-691〕;Travers〔Nature(1984)311410〕和Weintraub等〔Trends in Genetics(1985)122-25〕。McGarry和Lindquist〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83399-403〕报告了由热诱导的反向RNA(核糖核酸，以下简称RNA)抑制热休克蛋白的合成。植物细胞中表达的调节是通过向宿主植物细胞中整合入一段DNA序列来完成的，这段序列中包含一个基因，此基因中被转录的DNA序列至少有一部分与已由宿主细胞转录的DNA序列互补。这一已整合的外源性DNA将处于宿主植物细胞识别的转录起始区的转录控制之下。此已整合的外源DNA的转录将产生反向(anti-sense)RNA的多个拷贝，此反向RNA将与宿主细胞中的内源性RNA互补。这种反向的mRNA(信使核糖核酸，以下简称mRNA)将使天然存在之RNA的功能降低。图1示出PCGN 1401的EcoRI-BamHI切点间的片段。此片段相当于P1的5′部分，它包含编码成熟的多聚半乳糖醛酸酶蛋白质之N-末端的区域。下加横线的氨基酸是由DNA序列推论而来，并且与对纯化的多聚半乳糖醛酸酶所作的化学序列分析之结果相一致。图2是用各种质粒构建双载体PCGN783的构建流程图。本专利技术提供了调节RNA的利用，特别是调节宿主植物细胞表型性质的方法和组合物。该组合物包括有转录起始区与终止区的转录构建物，转录起始区与终止区之间由一段与RNA上特别是信使RNA上的序列(内源性的)互补的序列所隔开。借此，各种植物宿主细胞中原有的过程将可能被改变，以使各别蛋白质的生产可能降低，多酶过程可能被改变，特定的代谢途径可能被改变或受到抑制，从而有利于一种或多种其它的代谢途径，非蛋白质产物的生产降低，细胞分化改变等等。互补于信使RNA序列的序列通常至少约15个核苷酸，更常见的是至少20个核苷酸，较好是约30个核苷酸，更好是约50个核苷酸，也可能是100个或100个以上，但通常是少于5000个核苷酸，更多见的是少于2000个核苷酸，更尤其是少于1000个核苷酸。该序列可互补于mRNA序列的任何部位，亦即它可能邻近于5′末端或带帽状部位、带帽位点的下游区、处于带帽状位点与起始码之间，也可能覆盖非编码区的一部或全部，也可能处于连结非编码区与编码区之间区域，即或是互补于编码区的3′-末端，或是互补于mRNA的3′-非翻译区。该信使RNA可能是经加工过的或未加工的，即包括内含子的。因此非编码区即可能包含5′或3′非编码的侧翼区和内含子。反向序列结合的特定区域及反向序列的长度将根据想要达到的抑制程度而改变，也可根据序列的单一性(Uniqueness)，反向序列的稳定性等来改变。因此，在一定程度上，这些因素要根据就某一特定反向序列所观察到的实际情况从经验上来加以确定。这样的序列可是单一序列，也可是有二个或多个串联重复序列的重复序列，这时单一序列可与多个mRNA相结合。在某些情况下，异质重复结构可能比同质重复结构更适用，因为此时同一序列有对不同的mRNA的互补的区域，而对多种mRNA起抑制作用。反向序列可与单一序列或重复序列互补，以提高结合的机率。因此，反向序列可能涉及到与单一序列、重复序列中的一个单位或是一段重复序列中的多个单位相结合。反向意义可能导致单个基因或多个基因表达的改变。转录的结构将按转录的方向依次由下列部分组成转录起始区，正向链上为反向RNA编码的序列以及转录终止区。转录起始区可提供结构表达或调节表达。有许多在植物中具有功能的启动子可供利用。这些启动子可由Ti或Ri质粒、植物细胞、植物病毒、或其它其中启动基区表现有功能活性的植物宿主中得到。做为例证的启动子包括章鱼碱合成酶启动子、nopaline合酶启动子、manopine合成酶启动子等，这些均为细菌来源的、在植物中具有功能的启动子。病毒的启动子包括花椰菜花花叶病毒的全长(35S)和Ⅵ区启动子等。内源的植物启动子包括核糖-1，6-二磷酸(RUBP)羧化酶小亚单位(ssu)，β-conglycinin启动子，云扁豆蛋白启动子，ADH启动子，热休克启动子，组织特异性启动子(如与果实成熟有关的启动子)等。转录起动区可能是天然存在的区域、没有调节区的RNA聚合酶结合区或是一个基因的RNA聚合酶结合区与另一个基因调节区的结合部分。调节区可能是对一种物理刺激起反应，如热休克基因对热起反应，如RUBP羧化酶SSU对光起反应等。另一种可能是调节区可能对分化信号敏感，例如β-conglgcinin基因，云扁豆蛋白基因等。第三类调节基因是对代谢物起反应。反向RNA表达的时间和水平可能对产生的表型有一定的效应。因此选用的启动子将决定反向RNA的效应。可使用任何方便的终止区，如RNA聚合酶结合区的终止区或其它的终止区。多种不同的终止区均可利用，最主要的选择考虑是要方便，这样其前面的结构或DNA序列即可供利用。为方便起见，可用Opine的终止区，或内源性基因的终止区，例如前面已经谈到的基因。各个片段可用连结子、转接子等进行连结;如有方便的内切酶位点可供利用，则也可进行直接的连结。DNA序列，特别是连接到复制系统的DNA序列可做分步连接，此时存在于复制系统上的标志可供用于进行选择。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调节植物细胞内基因表达的方法，其包括：向所说的植物细胞基因组内整合一构建物，该构建物含有在所说的植物细胞中有功能的启动子、具有与所说细胞中内源性ＲＮＡ互补之可转录链的ｄＳＤＮＡ序列、以及在所说的细胞中有功能的终止区；培养含有所说 的构建物的所说的植物细胞，以使所说的互补链被转录并调节所说的内源性ＲＮＡ在所说细胞中的功能。

【技术特征摘要】
US 1986-3-28 USSN845676;US 1986-10-17 USSN920574之范围的前提下，实践中是可作某些改变的。权利要求1.一种调节植物细胞内基因表达的方法，其包括向所说的植物细胞基因组内整合一构建物，该构建物含有在所说的植物细胞中有功能的启动子、具有与所说细胞中内源性RNA互补之可转录链的dSDNA序列、以及在所说的细胞中有功能的终止区；培养含有所说的构建物的所说的植物细胞，以使所说的互补链被转录并调节所说的内源性RNA在所说细胞中的功能。2.根据权利要求1的方法，其中所说的内源性RNA是信使RNA。3.根据权利要求2的方法，其中调节所说的功能可导致某一表型的性状被改变。4.一种调节植物细胞中基因表达的方法，其包括向所说的植物细胞基因组中整合-构建物，该构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯廷K休梅克，琼C克厘德尔，威廉R希亚特，维克克瑙夫，
申请(专利权)人：加利福尼亚基因公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]