一种表达糖调节蛋白的方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物医学领域，涉及一种表达糖调节蛋白的方法及其应用。本发明专利技术通过将糖调节蛋白基因经改造成为可分泌型蛋白，装载于体外培养的肿瘤细胞，在肿瘤细胞中表达糖调节蛋白，刺激机体的抗肿瘤免疫功能，可制备肿瘤疫苗，对肿瘤进行免疫治疗。同时，在肿瘤中直接注射表达糖调节蛋白基因的腺病毒，感染肿瘤细胞，表达糖调节蛋白，并与化疗及放射治疗相结合，达到治疗肿瘤的目的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，涉及表达糖调节蛋白的方法，尤其涉及一种在肿瘤中表达糖调节蛋白的方法及其应用。
技术介绍
肿瘤细胞中包含有大量的基因突变，约11000突变/细胞，因而每一种肿瘤均有其独特的抗原肽，具有潜在的引起肿瘤免疫反应的功能。然而一般情况下肿瘤细胞并不能引起足够的免疫反应，其中很重要的一个原因是因为抗原递呈细胞功能不足或不适。因此提高肿瘤抗原的递呈，可能引起有效的抗肿瘤免疫反应。热休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)家族成员，如HSP 70，HSP 90，具有分子伴侣(chaperon)的功能，辅助新合成蛋白质完成二、三级结构。因此分子伴侣结构相对保守，对蛋白质结构、功能有非常重要的作用。同时，它还具有诱导激活抗原递呈细胞递呈抗原，并诱导CD8+或/和CD4+T-细胞活性的作用。近年来，以HSP作免疫治疗在动物实验和临床应用上的研究受到众多研究者的热切关注。糖调节蛋白(Glucose-Regulated Protein)为HSP90家族的一员，位于细胞内质网，其功能与蛋白质在内质网中的折叠与装配密切相关。同时它也具有递呈抗原肽，刺激机体抗肿瘤免疫反应的功能。糖调节蛋白与抗原递呈细胞(APC)结合，激活巨噬细胞或诱导树突状细胞的成熟，一方面其分泌出的I型IFN、IL-12及其它细胞因子，可激活NK，NKT和γδT细胞的活性，杀伤或裂解肿瘤细胞；另一方面，其产生的化学因子如NO等，也参与肿瘤细胞的裂解。被杀伤裂解的肿瘤释放出的肿瘤特异性抗原，又可经糖调节蛋白诱导激活的树突状细胞(DC)通过MHC-I路径激活肿瘤特异性CD8+T细胞，引发适应性抗肿瘤免疫反应。目前对HSP应用于肿瘤免疫治疗的研究，一般采用的方法是从肿瘤组织中提取HSP作为疫苗，注射回体内。这一方法已取得了较为满意的效果，有研究表明，以肿瘤自身来源糖调节蛋白作疫苗，可在约50％的治疗病人中引起抗肿瘤免疫反应。但是，从肿瘤组织中提取HSP在实际应用中有较大的局限性。如纯化过程对肿瘤抗原肽的丢失，HSP提取量受肿瘤大小的限制。并且针对每种肿瘤提取HSP，费用昂贵，不易建立标准化的方案，在临床应用上有一定的难度。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种新的表达糖调节蛋白的方法。本专利技术的进一步目的是提供在肿瘤细胞中表达分泌型的糖调节蛋白的方法。本专利技术通过将糖调节蛋白基因经改造成为可分泌型蛋白，装载于体外培养的肿瘤细胞，制备肿瘤疫苗，刺激机体的抗肿瘤免疫功。同时，在肿瘤中直接注射表达糖调节蛋白基因的腺病毒，感染肿瘤细胞，表达糖调节蛋白，并与化疗及放射治疗相结合，达到治疗肿瘤的目的。本专利技术采用腺病毒载体表达糖调节蛋白，利用腺病毒对肿瘤细胞感染效率高的特点，获得较大量的蛋白。同时，本专利技术将糖调节蛋白基因改造为分泌型，使其能在肿瘤细胞中合成后分泌到细胞外，结合并递呈肿瘤抗原肽至抗原递呈细胞，加上糖调节蛋白本身具有的激活机体先天性免疫功能的作用，因而能取得更好的效果，为有效的治疗方案提供基础。由于糖调节蛋白位于细胞内质网，现有的治疗研究多是从肿瘤组织中提取。本专利技术采用带分泌型糖调节蛋白基因的腺病毒感染肿瘤细胞，使其表达糖调节蛋白。一方面糖调节蛋白在分泌出细胞的过程中可携带特异性肿瘤抗原，刺激机体的抗肿瘤免疫反映；另一方面，糖调节蛋白引起机体的先天性免疫反应，对肿瘤生长、转移产生抑制作用。本专利技术的目的通过下述方法和步骤实现 1.采用PCR或其他方法分离并克隆糖调节蛋白基因，在引物设计时去掉编码蛋白质C末端氨基酸KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸)的序列。所述其他分离并克隆糖调节蛋白基因的方法还可选用筛选cDNA文库或人工合成DNA片段的方法。糖调节蛋白为位于细胞内质网的蛋白质，其蛋白质C末端含有将其固定于内质网膜上的一段氨基酸序列，称为“锚”(anchor)，即KDEL短肽。本专利技术用基因克隆的方法，在克隆基因时，去掉上述一段序列，使细胞在合成糖调节蛋白后分泌到细胞外。本专利技术采用序列1的人糖调节蛋白基因和序列2的小鼠糖调节蛋白基因。扩增人的糖调节蛋白基因所用引物序列为上游引物5′ACGCGTCGACATCGAAGGGGACTTGAGACTC 3′下游引物5′ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTCAGCTGTAGATTCCTTTGC 3′扩增小鼠的糖调节蛋白基因所用引物序列为2.将扩增的分泌型糖调节蛋白基因插入到包装复制缺陷型腺病毒的质粒载体中，然后在病毒包装细胞中生产可表达分泌型糖调节蛋白的腺病毒。3.利用该腺病毒对实验动物肿瘤组织或细胞的进行以下方式实验A.将病毒直接注入实验动物肿瘤组织中；或B.用病毒感染体外培养的肿瘤细胞后，经致死剂量的放射线照射，或化学药物处理，细胞不再分裂但可表达目的蛋白，收集细胞，经腹腔注射，进行免疫治疗。4.将上述方案与放疗或化疗，或其他物理疗法相结合。本专利技术具有如下优点1.腺病毒对肿瘤细胞感染效率高，可使分泌型糖调节蛋白蛋白大量表达。2.分泌型糖调节蛋白可在分泌出细胞时递呈肿瘤抗原，刺激机体的抗肿瘤免疫反应；并且其本身也引起机体的先天性免疫反应，对肿瘤生长产生抑制作用。3.糖调节蛋白诱导的全身免疫反应，不仅对局部肿瘤产生作用，对肿瘤转移也有抑制作用。附图说明图1.带分泌型糖调节蛋白基因的复制缺陷型腺病毒结构示意图，其中，分泌型糖调节蛋白基因去掉了将蛋白质固定在内质网上的C端KDEL序列，与绿色荧光蛋白(GFP)基因构成融合基因，由巨细胞病毒CMV启动子控制。图2.腺病毒介导的分泌型糖调节蛋白在小鼠乳腺癌细胞株4T1中的表达，其中，病毒感染4T1细胞，24小时后用放射线照射(第0天)，继续培养，每天收集培养上清液，用Weastern Blot方法进行检测。阴性对照为AdGFP感染的细胞培养上清。阳性对照为AdsGRP-GFP感染的Ad293细胞裂解液。抗糖调节蛋白抗体购自StressGen公司。图3.分泌型糖调节蛋白原位表达引起的抗肿瘤免疫反应，其中，A.4T1细胞以40MOI的AdsGRP-GFP病毒或AdGFP病毒感染后，按每只小鼠1×105细胞接种于同源的BALB/c小鼠背部皮下，隔日测量肿瘤体积。与对照组相比，糖调节蛋白病毒感染组肿瘤生长明显滞后(P＜0.05)。B.来自A中不同处理组肿瘤切片H&E染色结果，深染的小细胞提示淋巴细胞侵润。图4.分泌型糖调节蛋白预防性接种引起的抗肿瘤免疫反应，4T1细胞经AdsGRP-GFP(治疗组))或AdGFP(对照组)病毒感染后，致死剂量照射，按每只5×106细胞接种于小鼠皮下，经4次免疫后，A)于皮下接种1×1074T1细胞，观察及测量肿瘤体积。图中可见，糖调节蛋白免疫组可完全防止4T1肿瘤细胞的生长；B)取脾细胞体外激活后，用ELISpot方法检测干扰素IFN-γ分泌，糖调节蛋白免疫组明显高于对照组(P＜0.05)；C)取脾细胞体外激活后，与4T1细胞共同培养，检测抗肿瘤细胞活性，当脾细胞与肿瘤细胞的比例为50∶1以上时，糖调节蛋白免疫组脾淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性裂解活性明显高于对照组(P＜0.01)。图5.分泌型糖调节蛋白表达对小鼠肿瘤的治疗作用，将1×105个4T1细胞接种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达糖调节蛋白的方法，其特征是将糖调节蛋白基因改造成可分泌型糖调节蛋白，采用腺病毒载体在肿瘤细胞中表达所述糖调节蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李川源，刘珊玲，
申请(专利权)人：李川源，刘珊玲，
类型：发明
国别省市：65[中国|新疆]