改进的融合产物制造技术

本发明专利技术介绍了新型的改进融合产物。（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
由Kohler和Milstein在1975年所进行的小鼠骨髓瘤细胞与已被免疫的小鼠脾细胞的融合(Nature.256(1975)，495-497)，首次证实了连续获得产生同型(所谓的“单克隆的”)细胞系的可能性以及由这些杂交瘤制造的抗体在各种科学研究和医学珍断上的应用。制备杂交瘤的方法一般包括下列步骤(a)用一种致免疫剂免疫小鼠或大鼠一类动物。所用的免疫方案应该能够产生有用量的适当的已接触抗原的脾细胞。(b)从被免疫的动物体中取出脾脏，在一种合适的介质中制成脾脏悬浮液。(c)在一种合适的融合促进剂存在的条件下，将该悬浮的脾细胞与从一合适的细胞系得来的骨髓瘤细胞进行融合。融合促进剂可以是仙台病毒或是一化学融合剂，如平均分子量约1000至4000的聚乙二醇((PEG)(如商业上可得到的PEG1000等)。另一项有效的融合技术是根据已知方法的电-融合，如Zimmermann和Scheurich(Planta，151(1981)，26-32)、Vienken等(Planta，151(1983)，331)以及Jacob等(Sbud.Biophys，94(1983)，99)等所使用的方法。所用的骨髓瘤细胞系最好是所谓的“抗药”型，以便使未融合的骨髓瘤细胞在选择性培养基上不能存活，而杂种则能存活，最普通的一类是8-氮鸟嘌呤抗性细胞系，由于它缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，从而不能够在HAT(次黄嘌呤、氨基嘌呤和胸苷)培养基中存活。(d)在各个容器中用选择培养基稀释并培养未融合的脾细胞，未融合的骨髓细胞和融合细胞的混合物，这种培养基将不能维持未融合的骨髓细胞以长时间而使未融合细胞死亡(约一周)。稀释可以是一种有限型，其中稀释剂的体积是通过统计学方法计算出来的，以便分离一定量的细胞数(如微量滴定板的每一孔)。在选择性培养基中，未融合的骨髓瘤细胞死掉。由于未融合的脾细胞是非恶性的，它们仅有有限的代数，因此，经过一段时间后(约一周)，这些未融合的脾细胞将不能繁殖。而另一方面，融合细胞由于具有骨髓瘤亲本的恶性性质以及脾细胞亲本的在选择培养基上的存活能力，所以能够连续繁殖。(e)鉴定在含有杂交瘤的每一容器(孔)中的上清液中抗体的存在，这种抗体是直接抗最初所使用的抗原的。(f)筛选(如通过有限稀释)和克隆产生所需抗体的杂交瘤。一旦所需的杂交瘤被筛选和克隆，则最终的抗体可以通过两种方式之一产生。最纯的单克隆抗体是在试管中在一种合适的培养基上对所需的杂交瘤进行适当时间的培养而产生的。然后由上清液中回收所需要的抗体。该适宜的培养基和适当的培养周期为已知的或很易确定。这一试管技术生产的基本是单一的单克隆抗体，基本上无其它特定的抗人免疫球蛋白。既然培养基中含有异种血清(如牛胎儿血清)，所以该抗体中有少量的其它免疫球蛋白存在。但是，这一试管方法不能够产生用于某些目的的大量抗体或抗体浓缩物，因为单克隆抗体的浓度仅约50微克/毫升。为了产生在量的纯度稍底的单克隆抗体浓缩物，可以将所需的杂交瘤注射进小鼠中，最好是同源或半同源小鼠。适当培养一段时间后，杂交瘤将引起产生抗体的肿瘤的形成，导致宿主小鼠的血流和腹膜浸出液(腹水)中所需抗体的浓度增高(约为5～20毫克/毫升)。这一方法在文献中已充分公开，它有特别的和严重的缺点。PEG作为融合剂已被越来越多的人所接受，因为其纯品易于得到且在所需的分子量范围内，并且与仙台病毒比较起来它较容易操纵。但是，PEG有效的整个浓度范围非常窄。最佳浓度是50±5%(重量/体积)。在这一浓度下，它表现出对将被融合和已经融合了的所有细胞的细胞毒效应。另一方面，当使用亚最佳浓度的PEG时，仅现定到适度的细胞毒性，但是融合效率以及其后的杂交瘤形成都很低。与仙台病毒相比，已知的化学融合剂如PEG和电-融合不影响被融合的细胞的凝集，因此，细胞膜在紧密贴近处对融合并非直接有效。因此，本专利技术的目的之一就是提供能够产生有用产物的新型融合杂交细胞。本专利技术的目的之二是发展一种制备杂交细胞的方法，它是将能够产生有用产物的哺乳动物细胞或植物细胞(如胰岛细胞)与能够连续繁殖的合适的融合配偶体进行融合。本专利技术的目的之三是要减少常规的化学融合剂的细胞毒作用，这些融合剂包括PEG、溶血卵磷脂、葡聚糖、DMSO(二甲基亚砜)、聚乙烯醇、聚-L-鸟氨酸以及已知有用的盐如硝酸钠或其组合物。在融合方法中，这将导致产生高产量的所需的杂环交细胞。本专利技术的目的之四是产生将被电-融合技术融合的凝聚细胞。这些目的以及其它目的将在以下的叙述中清楚可见。从总体上讲，本专利技术涉及能够产生有用产物的融合杂交细胞，它是将非抗体产生哺乳动物细胞与一种能够连续繁殖的哺乳动物细胞融合而得到的，所说的融合通过首先一起凝聚然后影响凝聚细胞的融合而被简化。从总体上讲，本专利技术的另一个方面涉及植物细胞的凝聚和融合，以产生能够产生有用产物的杂交细胞。本专利技术涉及制备一个融合杂交细胞的方法，它是在选择性条件下将能够产生有用产物的非抗体产生的哺乳动物细胞与能够连续繁殖的哺乳动物细胞进行融合，它包括将被融合的细胞混合物与有效量的凝聚原接触，然后进行凝聚细胞的融合。在另一方面，本专利技术涉及植物细胞的凝聚和融合以产生能够产生有用产物的杂交细胞。本专利技术进一步涉及制备融合杂交细胞的方法，它包括将能够产生有用产物的植物细胞和能够连续繁殖的植物细胞与有效量的凝聚原接触，然后进行凝聚细胞的融合。本专利技术的另一方面是采用已知融合技术将能够产生有用产物的植物细胞的原生质体与能够连续繁殖的细胞(如根癌细胞)的原生质体进行融合，它借助或未借助预先或伴随的凝聚作用的帮助，这些杂交细胞具有产生所需的有用产物的能力。“凝集原”是一个用于描述任何具有凝集被融合细胞的能力的试剂的术语。虽然它包括所有的凝集原，但典型的凝集原是植物凝集素(PHA)、伴刀豆球蛋白A和花生凝集素。本专利技术优选的凝集原是PHA。凝集原的浓度应进行调整，使得观察不到细胞毒性作用，而发生明显程度的凝集作用。凝集原PHA的适当范围是25～400微克/毫升。较好的PHA浓度为约150～200微克/毫升，最好是200微克/毫升。其它凝集原的合适浓度可以采用本领域熟知的标准技术很容易地被确定。凝集作用是在生理温度(如37℃)下经过足够长时间(如5～15分钟)的处理而进行的。充分凝集后，就可进行细胞的融合。在一实施方案中，首先加入常规的化学融合剂(最好是PEG)，然后在生理条件下培养混合物，实现凝集细胞的融合。当使用PEG时，其浓度为约30～50%(重量/体积)。优选的PEG的浓度约为40±5%(重量/体积)。最佳融合时间约为1分钟。时间也可以更长，特别情况下达到2分钟以上，但随着时间的增加，存在着细胞毒性增加的危险。在另一实施方案中，凝集细胞的融合是通过电-融合实现的。与以前技术所产生的结果相比，本专利技术的这一新型融合技术导致形成的能存活杂交细胞明显增加。术语“有用产物”包括被融合的哺乳动物细胞或植物细胞可以产生的所有产物。典型的例子有生物活性蛋白、糖蛋白、多肽、酶和非蛋白质化合物，如生物碱、甾类、薯蓣皂苷配基、蒽醌、除虫菊酯、芳香油、多糖、强心苷、香料和美发油成分。能够由被融合的细胞产生的生物活性物质的典型例子如下面的表Ⅰ至Ⅴ所示。表1生物碱 杀虫剂变应原 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够产生有用产物的融合杂交细胞，它是通过非抗体产生哺乳动物细胞与能够连续繁殖的哺乳动物细胞的融合而得到的，所说的融合是通过首先引起凝聚然后进行凝聚细胞的融合而促进的。

【技术特征摘要】
US 1986-6-24 8780921.一种能够产生有用产物的融合杂交细胞，它是通过非抗体产生哺乳动物细胞与能够连续繁殖的哺乳动物细胞的融合而得到的，所说的融合是通过首先引起凝聚然后进行凝聚细胞的融合而促进的。2.一种能够产生有用产物的融合杂交细胞，它是通过一种植物细胞与一种能够连续繁殖的植物细胞的融合而得到的，所说的融合通过首先引入起凝聚，然后进行凝聚细胞的融合而促进的。3.由权利要求1或2的杂交细胞所产生的有用产物。4.一种制备杂交细胞的方法，它是在融合并在选择条件下将非抗体产生的哺乳动物细胞与能够连续繁殖的哺乳动物细胞融合而得到的，这一方法包括将被融合的细胞混合物与有效量的凝聚原相接触，然后进行凝聚细胞的融合。5.一种制备融合杂交细胞的方法，它包括将能够产生有用产物的植物细胞和能够连续繁殖的植物细胞与有效的凝集原接触，然后进行凝集细胞的融合。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于凝聚原是植物血球凝聚素。7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于其融合为化学融合。8.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于其融合为电-融合。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于其融合剂是平均分子量为1000至4000的PEG。10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于能够连续繁殖的植物细胞是根癌细胞。11.根据权利要求1所述的方法，其中连续繁殖的细胞是骨髓瘤细胞。12.根据权利要求1所述的能够产生胰岛素的融合杂交细胞，所说的细胞是胰岛细胞和骨髓瘤细胞的融合产物。13.根据权利要求1所述的能够产生胰高血糖素的融合杂交细胞，所说的细胞是胰岛细胞与骨髓瘤细胞的融合产物。14.根据权利要求1所述的能够产生生长激素抑制素的融合杂交细胞，所说的细胞是胰岛细胞与骨髓细胞的融合产物。15.根据权利要求1所述的能够产生ACTH的融合杂交细胞，所说的细胞是垂体前叶细胞与骨髓瘤细胞的融合产物。16.根据权利要求1所述的能够产生促黄体生成激素的融合杂交细胞，所说的细胞是垂体细胞与骨髓瘤细胞的融合产物。17.根据权利要求1所述的能够产生促滤泡素的融合杂交细胞，所说的细胞是垂体细胞与骨髓瘤细胞的融合产物。18.根据权利要求1所述的能够产生生长激素的融合杂交细胞，所说的细胞是垂体细胞与骨髓瘤细胞的融合产物。19.根据权利要求1所述的能够产生LH-RH(黄体生成素释放激素)的融合杂交细胞，所说的细胞是垂体细胞与骨髓瘤细胞的融合产物。20.根据权利要求1所述的能够产生促乳素的融合杂交细胞，所说的细胞是垂体细胞与骨髓瘤细胞的融合产物。21.根据权利要求1所述的能够产生促甲状腺素(TSH)的融合杂交细胞，所说的细胞是垂体细胞与骨髓瘤细胞的融合产物。22.根据权利要求1所述的能够产生胸腺激素的融合杂交细胞，所说的细胞是胸腺细胞与骨髓瘤细胞的融合产物。23.根据权利要求1所述的能够产生红血球生成素的融合杂交细胞，所说的细胞是肾细胞与骨髓瘤细胞的融合产物。24.根据权利要求1所述的能够产生表皮生长因子的融合杂交细胞，所说的细胞是颌下腺细胞与骨髓瘤细胞的融合产物。25.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：赛P三卡拉，
申请(专利权)人：默里尔多药物公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]