酿酒酵母菌株制造技术

本发明专利技术涉及制备具有发酵木糖的能力的糖发酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的方法，其中所述方法包括不同的程序步骤。该方法包括使第一形成孢子的酿酒酵母菌株与第二酿酒酵母单倍体菌株接合。其后，进行筛选接合的细胞，生长此类接合的细胞，和通过显微镜检查验证展现基本的形态学的接合的细胞。其后，进行产生接合的细胞的混合物，使混合物经受连续恒化器木质纤维素培养和进行获得具有发酵木糖的能力的糖发酵酿酒酵母细胞。本发明专利技术还包括通过所述方法获得的菌株。

Saccharomyces cerevisiae strain

The present invention relates to sugar fermentation ability of preparation of xylose fermentation of the strain (Saccharomyces cerevisiae) method, wherein the method comprises the steps of different procedures. The method includes combining a first spore forming yeast strain with a second Saccharomyces cerevisiae haploid strain. Subsequently, the cells were screened for conjugation, the growth of the cells of this type of conjugation, and the microscopic examination of the cells that showed the basic morphology. Subsequently, a mixture of the resulting cells is produced, the mixture is subjected to a continuous chemostat lignocellulose culture and a sugar fermenting Saccharomyces cerevisiae is obtained to obtain the ability to ferment xylose. The invention also comprises a strain obtained by the method.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术
本专利技术涉及制备具有发酵木糖的能力的糖发酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株的方法、如通过所述方法获得的酿酒酵母菌株和本专利技术的所述制备的菌株用于发酵含糖生物质的水解产物为乙醇的用途。
技术介绍
酵母属(Saccharomyces)菌株广泛用于酿造、蒸馏、烘烤、生物乙醇生产以及多种其他应用的工业中。鉴于酿酒酵母将糖(诸如葡萄糖、果糖、甘露糖、麦芽糖和蔗糖)转化为细胞物质并且将这些糖发酵为乙醇的能力，酿酒酵母是工业应用中使用最广泛的微生物之一。鉴于酿酒酵母菌株迅速地将糖类转化成乙醇的能力，酿酒酵母菌株被用于燃料工业中。酿酒酵母与细菌和其他酵母种类相比对发酵抑制剂和乙醇具有更好的耐受性。与细菌和若干酵母种类不同，野生型酿酒酵母不能使用戊糖(诸如木糖和阿拉伯糖)作为碳源。酿酒酵母在丰富碳源(诸如来自其他过程的侧流物和残留材料，诸如来自例如玉蜀黍和甘蔗渣的农业残留材料以及来自例如造纸的残留材料)上生长的能力具有巨大的环境价值以及还具有经济价值。农业残留材料和硬木衍生流物包含相当大部分的半纤维素，该半纤维素由许多不同的糖单体构成。举例来说，除葡萄糖以外，这些糖单体还可以包括木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖以及阿拉伯糖。葡萄糖和木糖是以最大量存在的糖单体并且因此代表一种用于使用酵母制造乙醇的重要碳源，提供了巨大的经济和环境优点。所提到的材料中木糖的丰度和使用酵母诸如酿酒酵母以利用木糖作为碳源产生乙醇的可能性，已经在这一
内导致密集的研究。然而，木糖的转化有时是差的，导致差的乙醇生产。此外，副产物木糖醇的产生已经是相当大的。编码提供使用木糖作为碳源的能力的酶的基因先前已被引入酿酒酵母中。利用blast搜索将来自Scheffersomyces stipitis的氨基酸序列Xyl1(木糖还原酶)和Xyl2(木糖醇脱氢酶)与酿酒酵母中的所有蛋白比较显示，与Xyl1最接的近同源物是Gre3p(Sc)E-值：3E-100，且Xyl2最接近于Sor1p、Sor2E-值1.4E-86至1E-77。E值越小，基因的同源性越大。因此，观察到序列之间的大同源性。EP 1 282 686公开了具有被并入的针对酶类木糖还原酶、木糖醇脱氢酶以及木酮糖激酶的基因并且已经经受特定突变的重组酿酒酵母菌株。所述菌株具有将木质纤维素原料发酵为乙醇的能力。Ep 1 282 686中所保藏的菌株是CBS 102679(TMB3400，Taurus01)并且在现有技术中总体上被认为是有效的。由菌株CBS 102679产生的乙醇与其他现有技术重组酵母相比已被认为是非常好的，但还产生不希望的副产物木糖醇。因此，在本领域内仍需要提供具有甚至更好的乙醇生产、更好的木糖转化以及更低的木糖醇生产的新型酿酒酵母菌株。WO2012/067572公开了以下酿酒酵母菌株：具有保藏号CBS128138的Taurus03、具有保藏号CBS 128139的Taurus04、具有保藏号CBS128140的Taurus07、具有保藏号CBS128141的Taurus10，其都是产生有益乙醇产率的木糖发酵酵母菌株。β-内酰胺酶基因被包括在至少如以上提到的菌株Taurus01、Taurus04和Taurus07中。鉴于β-内酰胺酶基因遗传转移到另一生物体(随后其潜在地可获得抗生素抗性)的风险，美国的监管机构不允许在较大生产设施中使用包含β-内酰胺酶基因的酿酒酵母菌株。在本
中仍对提供稳健的酿酒酵母菌株存在需要，所述菌株提供从5-和6-碳糖的高乙醇产率且另外表现出低的例如木糖醇的副产物产率。尤其需要在基因组中不具有以上提到的β-内酰胺酶基因的酿酒酵母菌株。专利技术概述鉴于以上，本专利技术涉及通过如以下描述的方法制备的有效的酿酒酵母菌株。所制备的菌株鉴于发酵介质例如生物质水解产物中存在的糖的总量在糖发酵期间达到的乙醇产率接近于可能的理论值。在一个方面，本专利技术涉及一种酿酒酵母菌株，所述菌株包含在其基因组中的编码木酮糖激酶的至少一个天然XKS1基因、在其基因组中的编码木糖醇脱氢酶的至少一个天然XDH1基因、和在其基因组中的至少一个modGre3基因，所述modGre3基因编码具有木糖还原酶活性的SEQ ID NO 1的氨基酸序列或编码具有木糖还原酶活性的所述氨基酸序列的片段，其中所述菌株通过以下步骤可获得：a)使第一酿酒酵母菌株形成孢子用于提供所述菌株的至少20个四分体，b)将从Scheffersomyces stipitis获得的编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的DNA和从酿酒酵母获得的编码木酮糖激酶的DNA引入第二酿酒酵母菌株，c)通过以下使第一形成孢子的酿酒酵母菌株与针对木糖演化的和处于单倍体状态的第二酿酒酵母菌株接合以提供接合的细胞：在YPD琼脂平板上将所述酿酒酵母单倍体菌株的细胞与在步骤a)中获得的每个四分体混合，d)在木糖和遗传霉素琼脂平板上筛选接合的细胞，e)在最小限定木糖液体培养基中生长来自步骤d)的接合的细胞，f)通过显微镜检查证实接合的细胞表现出出芽酵母的基本形态学特征，并选择具有基本形态学特征的此类接合的细胞，g)以等量从步骤f)产生具有基本形态学特征的接合的细胞的混合物，h)使混合物经受连续恒化器培养，所述连续恒化器培养最初在微需氧环境中和随后在厌氧环境中，所述连续恒化器培养使用以下供料策略：在数小时的循环时间范围中以供料和中断供料的循环以至少0.08h-1为限定木糖培养基供料，且随后以至少0.13h-1为恒定供料，i)在厌氧环境中使混合物经受连续恒化器培养，所述连续恒化器培养用来自步骤h)的细胞，使用木质纤维素，在数小时的循环时间范围中以供料和中断供料的循环以至少0.08h-1为木糖培养基供料，且以至少0.13h-1为恒定供料速率供料，j)通过从恒化器反应器收集具有发酵木糖的能力的糖发酵酿酒酵母细胞，获得所述细胞，k)将来自恒化器的细胞稀释到水中，然后将细胞平铺在YPD琼脂平板上以获得单菌落，并在30℃孵育持续至少4天。在又另一方面，本专利技术涉及为具有保藏号CBS137333的Taurus 13、具有保藏号CBS137663的Taurus 14、具有保藏号CBS137664的Taurus 15、具有保藏号CBS137665的Taurus 16、或具有保藏号CBS137666的Taurus 17的菌株。在又另一方面，本专利技术涉及如以上所描述的可获得的酿酒酵母菌株用于发酵含糖水解产物或生物质为乙醇的用途。附图简述图1.在基因组整合到酵母中使用的具有基因XYL1、XYL2和XKS1(红色箭头)的遗传元件，基因处在来自酿酒酵母糖酵解基因PGK1、TDH3和TPI1(为蓝色框的方形)的500nt上游启动子区域的控制下，编码基因的这些DNA区段以转录区域的终止(紫色方形)结束。用AarI消化DNA释放与基因GRE3(绿色线)的起点和终点互补的侧翼50nt核苷酸延伸段，据此利用用于将DNA转化到酵母中的DNA转化和随后的基因组整合的常用方法已经代替了酵母基因组中的GRE3基因之一，或由于与各自最接近的酵母同源物Gre3和Sor1/2的高DNA序列同源性，转化可引起Xyl1与天然Gre3和Xyl2与天然Sor1或Sor2的分别重组。DNA序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，所述菌株包含在其基因组中的编码木酮糖激酶的至少一个天然XKS1基因、在其基因组中的编码木糖醇脱氢酶的至少一个天然XDH1基因、和在其基因组中的至少一个modGre3基因，所述modGre3基因编码具有木糖还原酶活性的SEQ ID NO 1的氨基酸序列或编码具有木糖还原酶活性的所述氨基酸序列的片段，其中所述菌株通过以下步骤可获得：a)使第一酿酒酵母菌株形成孢子用于提供所述菌株的至少20个四分体，b)将从Scheffersomyces stipitis获得的编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的DNA和从酿酒酵母获得的编码木酮糖激酶的DNA引入第二酿酒酵母菌株，c)通过以下使第一形成孢子的酿酒酵母菌株与针对木糖演化的和处于单倍体状态的第二酿酒酵母菌株接合以提供接合的细胞：在YPD琼脂平板上将所述酿酒酵母单倍体菌株的细胞与在步骤a)中获得的每个四分体混合，d)在木糖和遗传霉素琼脂平板上筛选接合的细胞，e)在最小限定木糖液体培养基中生长来自步骤d)的接合的细胞，f)通过显微镜检查证实接合的细胞表现出出芽酵母的基本形态学特征，并选择具有基本形态学特征的此类接合的细胞，g)以等量从步骤f)产生具有基本形态学特征的接合的细胞的混合物，h)使混合物经受连续恒化器培养，所述连续恒化器培养最初在微需氧环境中和随后在厌氧环境中，所述连续恒化器培养使用以下供料策略：在数小时的循环时间范围中以供料和中断供料的循环以至少0.08h‑1为限定木糖培养基供料，且随后以至少0.13h‑1为恒定供料，i)在厌氧环境中使混合物经受连续恒化器培养，所述连续恒化器培养用来自步骤h)的细胞，使用木质纤维素，在数小时的循环时间范围中以供料和中断供料的循环以至少0.08h‑1为木糖培养基供料，且以至少0.13h‑1为恒定供料速率供料，j)通过从恒化器反应器收集具有发酵木糖的能力的糖发酵酿酒酵母细胞，获得所述细胞，k)将来自恒化器的细胞稀释到水中，然后将细胞平铺在YPD琼脂平板上以获得单菌落，并在30℃孵育持续至少4天。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.04.23 SE 1450484-9;2014.07.04 SE 1450851-91.一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，所述菌株包含在其基因组中的编码木酮糖激酶的至少一个天然XKS1基因、在其基因组中的编码木糖醇脱氢酶的至少一个天然XDH1基因、和在其基因组中的至少一个modGre3基因，所述modGre3基因编码具有木糖还原酶活性的SEQ ID NO 1的氨基酸序列或编码具有木糖还原酶活性的所述氨基酸序列的片段，其中所述菌株通过以下步骤可获得：a)使第一酿酒酵母菌株形成孢子用于提供所述菌株的至少20个四分体，b)将从Scheffersomyces stipitis获得的编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的DNA和从酿酒酵母获得的编码木酮糖激酶的DNA引入第二酿酒酵母菌株，c)通过以下使第一形成孢子的酿酒酵母菌株与针对木糖演化的和处于单倍体状态的第二酿酒酵母菌株接合以提供接合的细胞：在YPD琼脂平板上将所述酿酒酵母单倍体菌株的细胞与在步骤a)中获得的每个四分体混合，d)在木糖和遗传霉素琼脂平板上筛选接合的细胞，e)在最小限定木糖液体培养基中生长来自步骤d)的接合的细胞，f)通过显微镜检查证实接合的细胞表现出出芽酵母的基本形态学特征，并选择具有基本形态学特征的此类接合的细胞，g)以等量从步骤f)产生具有基本形态学特征的接合的细胞的混合物，h)使混合物经受连续恒化器培养，所述连续恒化器培养最初在微需氧环境中和随后在厌氧环境中，所述连续恒化器培养使用以下供料策略：在数小时的循环时间范围中以供料和中断供料的循环以至少0.08h-1为限定木糖培养基供料，且随后以至少0.13h-1为恒定供料，i)在厌氧环境中使混合物经受连续恒化器培养，所述连续恒化器培养用来自步骤h)的细胞，使用木质纤维素，在数小时的循环时间范围中以供料和中断供料的循环以至少0.08h-1为木糖培养基供料，且以至少0.13h-1为恒定供料速率供料，j)通过从恒化器反应器收集具有发酵木糖的能力的糖发酵酿酒酵母细胞，获得所述细胞，k)将来自恒化器的细胞稀释到水中，然后将细胞平铺在YPD琼脂平板上以获得单菌落，并在30℃孵育持续至少4天。2.根据权利要求1所述的菌株，其中所述第二酿酒酵母单倍体菌株从以下保藏的酵母菌株获得：具有保藏号CBS102679的Taurus 01、具有保藏号CBS128138的Taurus 03、具有保藏号CBS128139的Taurus 04、具有保藏号CBS128140的Taurus 07、具有保藏号CBS128141的Taurus 10，所述菌株已经移除了β-内酰胺酶基因，是单倍体并被演化工程化。3.根据权利要求1所述的菌株...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼克拉斯·博南德，
申请(专利权)人：斯堪的纳维亚科技集团公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE