本发明专利技术提供一株基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产富马酸的构建方法。采用具有天然木糖代谢能力的树干毕赤酵母作为宿主，敲除树干毕赤酵母三羧酸循环中的编码富马酸酶的基因PSfum1和PSfum2，获得了富马酸酶缺失菌株；在所获得的菌株的基础上异源表达优化的富马酸还原合成模块，利用木糖发酵富马酸的酵母合成菌株；在酵母合成菌株的基础上，表达经密码子优化的来自栗酒裂殖酵母的转运蛋白YMAE，获得了发酵木糖生产富马酸的树干毕赤酵母合成菌株；将获得的菌株在完全合成的发酵培养基中高效发酵木糖生产富马酸，发酵培养3～4天，温度30℃，150～200rpm，富马酸含量大于4g/L。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于合成生物学和生物能源
，具体涉及一种基于树干毕赤酵母合 成菌株发酵木糖生产富马酸的构建方法。以树干毕赤酵母（Scheffersomyces stipitis CBS6054)为宿主，敲除富马酸酶基因（PSfuml，PSfum2)，异源表达经密码子优化的来自米 根霉的富马酸还原合成途径和经密码子优化的来自栗酒裂殖酵母的富马酸转运蛋白YMAE， 获得了树干毕赤酵母合成菌株，在发酵培养基中高效发酵木糖生产富马酸的方法。
技术介绍
富马酸是一种典型的c4二羧酸平台化合物，被美国能源部列为二十一世纪优先发 展的12种平台化合物之一，可广泛应用于食品、化工、医药、涂料等行业，具有较高的附加 值。现阶段，富马酸主要通过石油化工合成，然而随着资源、能源、环境危机的日益加剧，利 用可再生资源生物合成富马酸，越来越受到关注目前，根霉菌是富马酸工业生物合成的主 要生产者，在有氧限氮条件下能自然发酵并产生大量的富马酸，并具有较高的产率。例如， 本课题组闻建平等（闻建平；于守智。飞秒激光诱变米根霉选育富马酸高产菌株的方法 。中国专利：CN102061294A，2011-05-18)利用飞秒激光诱变技术，选育出米根霉富马酸 高产菌株，突变株正突变率8~21%，发酵单位比原始菌株提高15~50%。然而，由于根 霉属真菌的复杂的生长形态，限制了发酵过程的可控性和工业化规模；同时由于丝状真菌， 特异性重组频率低，基因工程手段在其菌种改造方面仍很困难，限制了富马酸产量的进一 步提高。近年来，采用合成生物学，使非根霉菌生物合成富马酸的研宄越来越深入，并得到 了广泛的发展。刘立明等（刘立明；陈修来；杨松鑫；陈坚。一株产富马酸的光滑球拟酵母 工程菌的构建方法及应用。中国专利：CN102286387A，2011-12-21)以丙酮酸生产者光 滑球拟酵母为宿主，过表达来源于米根霉的苹果酸脱氢酶基因和富马酸酶基因，获得了重 组菌株T. glabrata FMME045,以葡萄糖为底物，发酵60h，富马酸产量比出发菌株增加了 6 倍，达到35mg/L。然而，利用经密码子优化的富马酸还原合成途径，以木糖等价格更为低廉 的原料为底物发酵生产富马酸的研宄尚未有报道。 木糖是木质纤维素的重要组成部分，是继葡萄糖之后自然界中最为丰富的糖类， 在纤维素水解液中含量超过30 %，在半纤维素水解产物中的含量超过90 %，有效利用木 糖是发展生物能源的关键问题之一。树干毕赤酵母具有宽广的碳源代谢能力，同时该菌具 有低pH与高糖耐受性和低木糖醇产量等优点，并已应用于发酵生产乙醇等产物（HUGHES STEPHEN R ；GIBB0NS WILLIAM R. Scheffersomyces stipitis strain for increased ethanol production and uses thereof.国外专利：US8609382, 2013-12-17)。为实现 木糖到富马酸转化提供了优秀合成菌种平台。 本专利技术首次以树干毕赤酵母（S. stipitis CBS6054)为宿主，敲除三羧酸循环中的 富马酸酶基因PSfuml和PSfum2,异源表达经密码子优化的来自米根霉的富马酸还原合成 途径和经密码子优化来自栗酒裂殖酵母的四碳二羧酸转运蛋白基因YMAE，获得了树干毕赤 酵母合成菌株，在完全合成的发酵培养基中高效发酵木糖生产富马酸。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产富马酸的 构建方法。为了实现本专利技术的技术目的，本专利技术采用了如下技术方案。 ，其步骤如下： (1)采用具有天然木糖代谢能力的树干毕赤酵母作为宿主，敲除树干毕赤酵母三 羧酸循环中的编码富马酸酶的基因PSfuml和PSfum2,获得了富马酸酶缺失菌株； (2)在所获得的富马酸酶缺失菌株的基础上异源表达优化的富马酸还原合成模 块，获得了利用木糖发酵富马酸的酵母合成菌株； (3)在所获得的酵母合成菌株的基础上，表达经密码子优化的来自栗酒裂殖酵母 的转运蛋白YMAE，获得了发酵木糖生产富马酸的树干毕赤酵母合成菌株； (4)将获得的树干毕赤酵母合成菌株在发酵培养基中发酵木糖生产富马酸，发酵 培养3~4天，发酵条件为30°C，150~200rpm。 所述步骤（2)中异源表达优化的富马酸还原合成模块优选是，将来自米根霉的富 马酸还原合成途径丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和富马酸酶的三个酶的基因，按照树干毕 赤酵母的密码子偏好性分别进行优化，获得基因YPYC、YMDH、YFUM。 所述步骤⑵中利用木糖发酵富马酸的酵母合成菌株优选是：将含有YMDH和 YFUM基因的质粒pYSS05和含有基因YPYC基因的质粒pBSS03导入富马酸酶缺失菌株中。 所述发酵培养基优选为：木糖50~60g/L，尿素0. 1~0. 2g/L，5~6g/L KH2P04， 2~5g/LMgS04?7H20,0? 2~0? 4mg/L生物素，1~2mg/L维生素 Bl，1~2mg/L维生素B6， 1~2mg/L烟酸，0. 2~0. 4mg/L对氨基苯甲酸，1~2mg/L泛酸妈，10mL/L微量金属元素母 液。微量金属元素母液优选包括 0. 05 ~0. lg/L CuS04 ? 5H20, 2 ~5g/L FeS04 ? 7H20， 0? 2 ~0? 4g/L MnCl2 ? 4H20,2 ~3g/L CaCl2 ? 2H20,0. 5 ~0? 6g/L ZnCl2,0. 04 ~0? lg/L NaMo042H20,0. 03~0? lg/L C〇C12,0. 1~0? 2g/L H3B04,0. 01~0? 05g/LKI。 具体方法为： (1)采用具有天然木糖代谢能力的树干毕赤酵母作为宿主，敲除树干毕赤酵母三 羧酸循环中的编码富马酸酶（FUM)基因，以阻断富马酸至苹果酸的转化途径。 S. stipitis中富马酸酶包含两个同工酶PSfuml和PSfum2。分别以S. stipitis基 因组为模板，设计引物 FUM1-5F/FUM1-5R，FUM1-3F/FUM1-3R 和 FUM2-5F/FUM2-5R，FUM2-3F/ FUM2-3,其序列为SEQ ID N0:33，SEQ ID N0:34，SEQ ID N0:35，SEQ ID N0:36，SEQ ID NO: 37，SEQ ID N0:38,分别扩增PSfuml和PSfum2的上下游同源片段。通过同源重组的方法分 别敲除基因PSfuml和PSfum2,获得了富马酸酶缺失菌株。 (2)将来自米根霉的富马酸还原合成途径的三个酶丙酮酸羧化酶（PYC)、苹果酸 脱氢酶（MDH)和富马酸酶（FUM)的基因分别按照树干毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优 化，获得基因 YPYC、YMDH 和 YFUM，其序列分别为 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2 和 SEQ ID NO: 3〇 进一步在（1)所获得的酵母合成菌株的基础上，异源表达优化的富马酸还原合 成途径模块，将含有YMDH和YFUM基因的质粒pYSS03(图1)和含有YPYC基因的质粒 pBSS02(图2)导入树干毕赤酵母中，获得了初步利用木糖本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于树干毕赤酵母合成菌株发酵木糖生产富马酸的构建方法，其特征是步骤如下：(1)采用具有天然木糖代谢能力的树干毕赤酵母作为宿主，敲除树干毕赤酵母三羧酸循环中的编码富马酸酶的基因PSfum1和PSfum2，获得了富马酸酶缺失菌株；(2)在所获得的富马酸酶缺失菌株的基础上异源表达优化的富马酸还原合成模块，获得了利用木糖发酵富马酸的酵母合成菌株；(3)在所获得的酵母合成菌株的基础上，表达经密码子优化的来自栗酒裂殖酵母的转运蛋白YMAE，获得了发酵木糖生产富马酸的树干毕赤酵母合成菌株；(4)将获得的树干毕赤酵母合成菌株在发酵培养基中发酵木糖生产富马酸，发酵培养3～4天，发酵条件为30℃，150～200rpm。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：闻建平，魏亮，刘蛟，齐海山，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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