栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。本发明专利技术由栖土曲霉获得的能够对无活力组织进行伤口清创的蛋白酶，清创能力强、副作用小，并且制备工艺简单、产量高。

【技术实现步骤摘要】
栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用
本专利技术涉及一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。
技术介绍
压疮、糖尿病足、烧伤及慢性伤口内存在很多失活组织。失活组织是机会性感染的优良培养基，会阻碍伤口的愈合。因此有效的清创是必要的。目前临床上最常用的清创方式仍是手术清创。除此之外，还有采用蛋白水解酶的酶清创。酶清创可以将坏死或失活的组织分解清除，同时又不损害邻近正常组织，从而达到清创目的。己有描述将枯草菌蛋白酶、胶原酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶及链激酶作为清创剂。但这些清创酶各有优缺点，并且早期清创效果尚未能完全令人满意。己发现栖土曲霉能够广生水解能力很强的栖土曲霉中性蛋白酶。但把栖土曲霉蛋白酶作为伤口清创酶并未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种清创能力强、副作用小，并且制备工艺简单、产量高的栖土曲霉蛋白酶在制 备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。本专利技术的技术解决方案是:一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。所述伤口为烧伤伤口、压疮伤口、慢性感染伤口或糖尿病足伤口。所述栖土曲霉蛋白酶由下列步骤制得:(I)培养基的制备发酵培养基配比为:麸皮3%、米糠1%、玉米粉1%、KH2PO40.4%，加水至100%，并于120°C下高温灭菌30分钟；(2)粗酶液的制备液将栖土曲霉3.942菌种按培养基8%的重量接种后，在250r/min振荡器中30°C下培养72小时；终止培养后，将发酵培养物于离心机中3000r/min离心10分钟，取上清液即为粗酶液；(3)栖土曲霉蛋白酶的分离粗酶液过滤，滤液调节pH至7.0，加入20%浓度的单宁酸，边加边搅拌；单宁酸用量为粗酶液重量的1% ;待沉淀完全后离心，收集沉淀；沉淀用pH7.2,0.02M磷酸缓冲液溶解；使用聚乙二醇洗脱单宁酸，在搅拌下加入10%浓度的PEG，使PEG与单宁酸之比值达到3: lml/g ;离心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，静置过夜，离心，收集沉淀；沉淀再浸泡于冷丙酮，静置过夜，然后过滤，沉淀用乙醚再洗涤一次，干燥即得栖土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制剂；(4)栖土曲霉蛋白酶的纯化上述丙酮粉粗酶用pH8.4,0.05Μ Tris -HCL 缓冲液溶解，上 DEAE -Sephadex A -25柱，然后用平衡缓冲液洗涤；层析共分离出7个峰，酶活力存在于Ρ2峰内；收集Ρ2峰，对水于低温下透析至无盐止，再用PEG脱水浓缩后，冷冻干燥。(5)蛋白酶活力的测定采用福林酚法测定蛋白酶活力。酶活定义为在40°C，适当的PH条件下，I分钟内水解酪蛋白产生I微克酪氨酸所需的酶量为I个蛋白酶活力单位。测得栖土曲霉蛋白酶冷干粉的酶活力为1.1xio5u/g。本专利技术由栖土曲霉获得的能够对无活力组织进行伤口清创的蛋白酶，清创能力强、副作用小，并且制备工艺简单、产量高。下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。【具体实施方式】栖土曲霉 蛋白酶的制备(I)培养基的制备发酵培养基配比为:麸皮3%、米糠I %、玉米粉HKH2PO40.4%，加水至100%并于120°C下高温灭菌30分钟。(2)粗酶液的制备液将栖土曲霉3.942菌种按培养基8%的重量接种后，在250r/min振荡器中30°C下培养72小时。终止培养后，将发酵培养物于离心机中3000r/min离心10分钟，取上清液即为粗酶液。(3)栖土曲霉蛋白酶的分离粗酶液过滤，滤液调节pH至7.0。加入20%质量浓度的单宁酸，边加边搅拌。单宁酸用量为粗酶液重量的I %。待沉淀完全后离心，收集沉淀。沉淀用pH7.2,0.02M磷酸缓冲液溶解。使用聚乙二醇(PEG)洗脱单宁酸。在搅拌下加入10%质量浓度的PEG，使PEG (ml)与单宁酸(g)之比值达到3:1。离心，收集上清液，加人2倍重量的冷丙酮，静置过夜，离心，收集沉淀。沉淀再浸泡于冷丙酮，静置过夜，然后过滤，沉淀用乙醚再洗涤一次，干燥即得栖土曲霉蛋白酶丙酮粉粗制剂。(4)栖土曲霉蛋白酶的纯化上述丙酮粉粗酶用少量pH8.4,0.05Μ Tris - HCL缓冲液溶解，上DEAE - SephadexA-25柱，然后用平衡缓冲液洗涤。层析共分离出7个峰，酶活力存在于Ρ2峰内。收集Ρ2峰，对水于低温下透析至无盐止，再用PEG脱水浓缩后，冷冻干燥。(5)蛋白酶活力的测定采用福林酚法测定蛋白酶活力。酶活定义为在40°C，适当的PH条件下，I分钟内水解酪蛋白产生I微克酪氨酸所需的酶量为I个蛋白酶活力单位。测得栖土曲霉蛋白酶冷干粉的酶活力为1.lX105U/g。实施例1:烧伤组织体外酶清创效果将猪耳皮片烧伤并将其经受栖土曲霉蛋白酶蛋白水解作用，监测由栖土曲霉蛋白酶对组织的裂解时间。根据如下方法进行分析:通过将皮肤与软骨分离并去除多余脂肪制备猪耳皮肤。煮沸猪耳皮片(约直径lcm) 20分钟模拟烧伤皮肤。将0.1g栖土曲霉蛋白酶粉与水相5ml混合，调节PH为7.0,并使用装配有塑料管的注射器或吸量管将其应用于细胞底部。在37°C的环境下孵育，检测猪耳皮肤的裂解时间。结果显示栖土曲霉蛋白酶于63.2±10.2分钟内对烧伤的猪耳皮肤进行了清创。结果详见表1。表1:栖土曲霉蛋白酶的烧伤组织体外清创活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。

【技术特征摘要】
1.一种栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用，其特征是:所述伤口为烧伤伤口、压疮伤口、慢性感染伤口或糖尿病足伤口。3.根据权利要求1或2所述的栖土曲霉蛋白酶在制备伤口清创、促进伤口愈合的药物中的应用，其特征是:所述栖土曲霉蛋白酶由下列步骤制得: (1)培养基的制备 发酵培养基配比为:麸皮3%、米糠1%、玉米粉1%、KH2P04 0.4%，加水至100%，并于120°C下高温灭菌30分钟； (2)粗酶液的制备液 将栖土曲霉3.942菌种按培养基8%的重量接种后，在250r/min振荡器中30°C下培养72小时；终止培养后，将发酵培养物于离心机中3000 r/min离心10分钟，取上清液即为粗酶液； (3)栖土曲霉蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宏林，朱昌来，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32