一种诱导剂及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种诱导在大肠杆菌表达系统中进行外源蛋白表达的诱导剂，该诱导剂包括蛋白乳清粉，进一步包括蔗糖。本发明专利技术还提供了所述诱导剂在大肠杆菌中诱导表达IBDV重组抗原蛋白的应用。该诱导剂能促进外源蛋白高效表达，可有效增加外源蛋白表达量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的诱导剂及其应用，属于基因工程药物制备领域。
技术介绍
目前，在大肠杆菌表达外源蛋白的研究，多以IPTG(异丙基-β-D巯基半乳糖苷)作为诱导剂诱导表达，但因为IPTG使异源蛋白的合成速度太快，以致于没有足够的时间进行折叠，当存在二硫键时，二硫键不能正确配对，过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度，多以包涵体的形式存在，导致可溶性蛋白含量很低(陈圆圆等，包涵体的形成原因及其处理方法.上海畜牧兽医通讯，2009,1:62)。而实验结果显示有些包涵体通过复性后失去了免疫活性，因此如何增加此类蛋白的可溶性表达量成了关键问题。另外，IPTG具有潜在的毒性(金奇.医学分子病毒学.北京:科学出版社,2001)，对菌体生长具有一定的抑制作用，各国药典均不提倡使用，并且价格昂贵，因而不适宜在发酵罐中进行基因工程产品的规模化生产。传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)导致的，以法氏囊肿大、肝脏损伤为主要特征的高度接触性传染病。随着我国养鸡业的集约化发展，传染性法氏囊病已成为危害养鸡业的一种主要传染病，目前，亟需免疫原性好、安全性高的新型亚单位疫苗问世。现有技术中，主要以IBDV VP2蛋白作为免疫原性蛋白研制亚单位疫苗，以大肠杆菌表达为主，但IBDV VP2是在细胞内产生的异源蛋白，因为真核糖蛋白无法糖基化使中间体溶解度下降，导致不溶解的包涵体形成(William Selleck,Song Tan.Recombinant Protien Complex Expression in E.coli.Current Protocols in Protein,Science,2008,
21(5):324-321),可溶性蛋白产量较低，实验结果显示IBDV VP2所形成的包涵体通过复性后没有免疫活性。
技术实现思路
为克服现有技术的缺陷和不足之处，本专利技术的第一方面在于提供一种诱导在大肠杆菌表达系统中进行外源蛋白表达的诱导剂，其中，所述诱导剂包括蛋白乳清粉。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的所述诱导剂包括蛋白乳清粉和蔗糖。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的诱导剂中，所述蛋白乳清粉包括高蛋白乳清粉、中蛋白乳清粉、低蛋白乳清粉。其中，所述高蛋白乳清粉中，水分≤5％,蛋白质≥11％,灰分≤8％,乳糖≥68％,脂肪≤1.5％；所述中蛋白乳清粉中蛋白≥6％，乳糖≥75％，脂肪≤1.5％；所述低蛋白乳清粉中，蛋白≥2％，乳糖为82％-85％，脂肪≤1％。术语“蛋白乳清粉”又称为“乳清蛋白”(whey protein)，是经巴氏杀菌法、脱盐、蒸发浓缩和喷雾干燥制成的，主要用于食品工业，特别是焙烤、糕饼制造和乳制品工业中，外观均为淡颜色，没有结块(如有轻微结块也可轻微碾开)，没有非乳清的味道和气味；还可添加至动物饲料中，因乳清粉能提供大量的乳糖，在仔猪的消化道内发酵可产生大量的乳酸，帮助乳的消化，抑制致病细菌的生长，因而主要用于乳猪饲料的添加。奶牛及肉牛、狗和猫，家禽以及其他动物也从乳清蛋白产品的使用中不同程度的获得营养益处。术语“蛋白乳清粉”按蛋白含量高低可分为三种：高蛋白乳清粉水分≤5％,蛋白质≥11％,灰分≤8％,乳糖≥68％,脂肪≤1.5％；中蛋白乳清粉蛋白≥6％，乳糖≥75％，脂肪≤1.5％；低蛋白乳清粉蛋白≥2％，乳糖为82％-85％，脂肪≤1％。因其成本很低，且可以达到很好的诱导效果，所以可以大大节约生产成本。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的所述诱导剂包括150-300g/L低蛋白乳清粉，5-20g/L七水硫酸镁，10-25g/L胰蛋白胨，15-40g/L酵母提取物。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术的所述诱导剂包括150g/L低蛋白乳清粉，15g/L七水硫酸镁，15g/L胰蛋白胨，30g/L酵母提取物。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术的所述诱导剂包括150-300g/L低蛋白乳清粉，50-200g/L蔗糖，5-20g/L七水硫酸镁，10-25g/L胰蛋白胨，15-40g/L酵母提取物。作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术的所述诱导剂包括150g/L低蛋白乳清粉，150g/L蔗糖，15g/L七水硫酸镁，15g/L胰蛋白胨，30g/L酵母提取物。本专利技术的第二方面在于提供了一种使用所述诱导剂在大肠杆菌中诱导表达IBDV重组抗原蛋白的方法，所述方法包括：(1)将含IBDV VP2的重组质粒的宿主菌依次制备成一级种子和二级种子；(2)发酵和诱导：将所述步骤(1)中所述二级种子接种于含发酵培养基的发酵罐中，37℃培养，当DO值降至15％时缓慢增加通气量至400-800L/h；当pH上升、DO值上升时开始按DO值反馈慢速流加补料培养基，至DO值大于35％时自动流加补料培养基；当菌体浓度OD600为10-25时降温至诱导温度后开始添加含抗生素的所述诱导剂进行诱导，至DO值大于35％时慢速流加含抗生素的所述诱导剂，于诱导时间结束后收取发酵液，离心后收取含IBDV重组抗原蛋白的菌体。作为本专利技术的一种实施方式，本专利技术的诱导表达IBDV重组抗原蛋白的方法中，所述步骤(2)发酵和诱导步骤为：所述的二级种子接种于含发酵培养基的发酵罐中，37℃培养，初始搅拌为100-300rpm，初始通气量为100-300L/h，当DO值降至15％时缓慢增加通气量至400-800L/h；当pH上升、DO值上升时开始慢速流加补料培养基，至DO值大于35％时自动流加补料培养基；当菌体浓度OD600为10-25时降温至诱导温度后开始添加含抗生素的所述诱导剂进行诱导，至DO值大于35％时慢速流加含抗生素的所述诱导剂，于诱导时间结束后收取发酵液，离心后收取含IBDV重组抗原蛋白的菌体。作为本专利技术的一个实施方式，本专利技术的诱导表达IBDV重组抗原蛋白的方法中，所述步骤(1)中所述含IBDV VP2的重组质粒的宿主菌制
备方法包括：I提取鸡传染性法氏囊病病毒的总RNA；II将IBDV VP2基因利用基因工程手段构建大肠杆菌重组质粒载体，并制备大肠杆菌重组质粒的宿主菌。作为本专利技术的一个优选实施方式，所述含IBDV VP2的重组质粒的宿主菌为DH5α(DH5α-VP2)、BL21(DE3-VP2)。优选地，所述宿主菌的制备方法之所述步骤II中所述大肠杆菌重组质粒可通过本领域的常规方法构建而成，即将IBDV VP2基因插入到大肠杆菌表达载体合适的限制性内切酶位点之间，使IBDV VP2基因可操作的与大肠杆菌表达调控序列相连接；更优选地，将IBDV VP2基因核苷酸序列插入到大肠杆菌表达载体pColdIII的多克隆位点之间，使所述核苷酸序列冷休克基因(CspA)启动子和lacZ启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达载体。优选地，所述宿主菌的制备方法之所述步骤II中所述大肠杆菌重组质粒可通过常规的方法转化宿主菌，所述宿主菌又称宿主细胞，所述宿主细胞的类型可为DH5α、BL21；更优选地，将大肠杆菌重组质粒采用CaCl2转化方法转化BL21(DE3)大肠杆菌株(E Coli.BL21(DE3))。作为本专利技术的一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导在大肠杆菌表达系统中进行外源蛋白表达的诱导剂，其中，所述诱导剂包括蛋白乳清粉。

【技术特征摘要】
1.一种诱导在大肠杆菌表达系统中进行外源蛋白表达的诱导剂，其中，所述诱导剂包括蛋白乳清粉。2.根据权利要求1所述的诱导剂，其中，所述诱导剂还包括蔗糖。3.根据权利要求1所述的诱导剂，其中，所述蛋白乳清粉包括高蛋白乳清粉、中蛋白乳清粉、低蛋白乳清粉。4.根据权利要求1所述的诱导剂，其中，所述诱导剂包括150-300g/L低蛋白乳清粉，5-20g/L七水硫酸镁，10-25g/L胰蛋白胨，15-40g/L酵母提取物；优选地，所述诱导剂包括150g/L低蛋白乳清粉，15g/L七水硫酸镁，15g/L胰蛋白胨，30g/L酵母提取物。5.根据权利要求2所述的诱导剂，其中，所述诱导剂包括150-300g/L低蛋白乳清粉，50-200g/L蔗糖，5-20g/L七水硫酸镁，10-25g/L胰蛋白胨，15-40g/L酵母提取物；优选地，所述诱导剂包括150g/L低蛋白乳清粉，150g/L蔗糖，15g/L七水硫酸镁，15g/L胰蛋白胨，30g/L酵母提取物。6.一种使用权利要求1～5任一项所述的诱导剂在大肠杆菌中诱导表达IBDV重组抗原蛋白的方法，所述方法包括：(1)将含IBDV VP2的重组质粒的宿主菌依次制备成一级种子和二级种子；(2)发酵和诱导：将所述步骤(1)中所述二级种子接种于含发酵培养基的发酵罐中，37℃培养，当DO值降至15％时缓慢增加通气量至400-800L/h；当pH上升、DO值上升时开始按DO值反馈慢速流加补料培养基，至DO值大于35％时自动流加补料培养基；当菌体浓度OD600为10-25时降温至诱导温度后开始添加含抗生素的所述诱导剂进行诱导，至DO值大于35％时慢速流加含抗生素的所述诱导剂，于诱导时间结束后收取发酵液，离心后收取含IBDV重组抗原蛋白的菌体；优选地，所述步骤(2)发酵和诱导步骤为：所述二级种子接种于含
\t发酵培养基的发酵罐中，37℃培养，初始搅拌为100-300rpm，初始通气量为100-300L/h，当DO值降至15％时缓慢增加通气量至400-800L/h；当pH上升、DO值上升时开始慢速流加补料培养基，至DO值大于35％时自动流加补料培养基；当菌体浓度OD600为10-25时降温至诱导温度后开始添加含抗生素的所述诱导剂进行诱导，至DO值大于35％时慢...

【专利技术属性】
技术研发人员：张许科，孙进忠，耿笑林，田克恭，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41