一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明专利技术通过构建重组质粒pulA/pSVEB，并转化至短小芽孢杆菌Brevibacillus brevis(CCTCC AB94025)中，得到重组菌pulA/pSVEB/Brevibacillus brevis。该菌株产普鲁兰酶的发酵培养基为：葡萄糖30g/L，牛肉浸膏30g/L，棉籽粉5g/L，MgCl2·6H2O 12g/L。培养条件为：发酵温度30℃，pH为7.0。本发明专利技术实现了普鲁兰酶在短小芽孢杆菌中的胞外表达，3L罐发酵72h，发酵上清液酶活可达988.5U/mL。本工艺采用工业上常用的葡萄糖、棉籽粉、牛肉浸膏、无机盐等原料进行生产，简单易行，适用于大规模生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于基因工程和酶 工程

技术介绍
普鲁兰酶是一种能够水解普鲁兰多糖、支链淀粉、a-极限糊精等分子中的 a-1，6葡萄糖苷键的淀粉脱支酶。由于糖化酶等对糊精中的a-1，6-糖苷键水解效率很 低，往往导致反应时间较长、副产物较多等问题。而普鲁兰酶能快速切割糊精中的分支点， 与糖化酶协同作用，可大幅度缩短反应时间，提高原料的转化率。因此被广泛应用于葡萄 糖、果糖、麦芽糖、麦芽糊精、低聚糖等产品的生产中。 近年来，对于普鲁兰酶的开发已经成为了研究热点。然而，大部分的研究局限于 在大肠杆菌中表达。由于大肠杆菌是一种条件性致病菌，这就极大地限制了普鲁兰酶在 食品工业中的应用。虽然也有一些研究者将普鲁兰酶在非致病菌中进行表达，但表达量 都很低。例如，张艳等将Bacillusnaganoensis来源的普鲁兰酶克隆于枯草芽孢杆菌 中，酶活为10. 94U/mL，再经刘逸寒等发酵优化，酶活为20. 16U/mL;谢银珠等将Bacillus deramificans来源的普鲁兰酶克隆于地衣芽孢杆菌中，经发酵优化，酶活为1. 5ASPU/mL。 因此，实现普鲁兰酶在非致病菌中过量表达，对普鲁兰酶在食品工业中的应用具有重大意 义。 短小芽孢杆菌作为一种宿主菌表达异源蛋白，近年来受到了研究者的关注。首 先，它是一种非致病菌，可应用于食品工业；其次，它能过量合成活性异源蛋白，表达量可达 lmg/mL以上；再次，它属于革兰氏阳性菌，只有一层细胞膜，蛋白的胞外分泌良好。此外，它 还有培养条件简单，生长周期较短等优点，非常适合于表达普鲁兰酶。【专利技术内容】 本专利技术的目的是提供一种高产普鲁兰酶的重组短小芽孢杆菌。 所述重组菌以短小芽孢杆菌为宿主，通过重组质粒pulA/pSVEB表达来源于脱支 芽孢杆菌的普鲁兰酶突变体。 在本专利技术的一种实施方式中，所述普鲁兰酶是来源于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶 (GenBank号为AX203845)的突变体。本专利技术以普鲁兰酶突变体为例进行说明，保护范围不 限于此。 在本专利技术的一种实施方式中，所述短小芽孢杆菌宿主为Brevibacillusbrevis CCTCCAB94025。 在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒pulA/pSVEB是将缺失了启动子和信 号肽的PWB980、普鲁兰酶表达元件、缺失了信号肽的pET20b(+)连接成环得到的；所述普鲁 兰酶表达元件包括来源于短小芽孢杆菌的外壁蛋白启动子P2、外壁蛋白信号肽和来源于脱 支芽孢杆菌的普鲁兰酶突变体基因。 在本专利技术的一种实施方式中，所述普鲁兰酶突变体的基因序列与CN201310610426. 4中构建的D437H/D503Y/d2突变体的序列一致，为N端的CBM41和X25两个 结构域删除了的且发生了D437H和D503Y突变的突变体。 在本专利技术的一种实施方式中，所述普鲁兰酶表达元件的核苷酸序列如SEQID NO. 1所示。 在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒pulA/pSVEB的核苷酸序列是按照 PWB980缺失启动子和信号肽后的序列、普鲁兰酶表达元件序列、pET20b(+)缺失信号肽后 的序列，这样的方式进行连接成环得到的。 在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒pulA/pSVEB的具体构建方法如下： (1)合成核苷酸序列如SEQIDN0. 2所示的DNA片断； (2)用NdeI和NcoI双酶切在pET-20b(+)基础上构建的表达D437H/D503Y/d2 突变体的重组质粒（一种分泌效率和热稳定性提高的普鲁兰酶突变体及其制备方法.CN 201310610426. 4)，得到含有普鲁兰酶突变体基因pulA和去除pelB信号肽的pET20b(+)的 DNA片断； (3)以核苷酸序列如SEQIDN0. 3、SEQIDN0. 4所示的引物PI、P2扩增pWB980， 得到缺失了P43启动子序列和信号肽序列的pWB980片断； (4)使用In-Fusion酶将步骤（1)、（2)、⑶得到的片段进行连接，筛选即得到重 组质粒pulA/pSVEB。 本专利技术还提供了一种所述重组菌的构建方法，所述方法是： (1)按照缺失了启动子和信号肽的pWB980、SEQIDNO. 1所示的普鲁兰酶表达元 件、缺失了信号肽的pET20b(+)的顺序，将这三段核苷酸序列用In-Fusion酶连接，得到重 组质粒pulA/pSVEB; (2)将重组质粒pulA/pSVEB电转至短小芽抱杆菌BrevibacillusbrevisCCTCC AB94025 中，得到重组菌pulA/pSVEB/Brevibacillusbrevis。 本专利技术还提供一种利用所述重组菌生产普鲁兰酶的方法。 在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将重组菌种子液接种至发酵培养基，于 25-37°C发酵培养 46-50h。 在本专利技术的一种实施方式中，种子液使用的种子培养基为TM培养基，其组成为： 葡萄糖l〇g/L，多聚蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母粉2g/L，微量元素10mL/L，卡那霉素 30yg/mL;其中微量元素液组成为：FeS04.7H20lg/L，MnS04.4H20lg/L，ZnS04.7H20 0?lg/ L〇 在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基中含有葡萄糖10_50g/L，棉籽粉 l-10g/L，牛肉浸膏 10-30g/L，MgCl2 ? 6H20l-20g/L和卡那霉素。 在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体是：将重组菌种子液接种至发酵罐， 控制温度25-37°C、溶氧10-50%、pH5. 0-7. 0,并流加葡萄糖维持发酵液中残糖浓度为 l-30g/L〇 在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将培养好的种子液接入装有发酵培养 基的发酵罐中，控制在30 °C、pH为7. 0±0. 1、通风量1.Ovvm、溶氧为30 %、残糖浓度在 5g/L以上，培养72h;其中发酵培养基为：葡萄糖30g/L，牛肉浸膏30g/L，棉籽粉5g/L， MgCl2 ? 6H2012g/L和卡那霉素。 本专利技术的有益效果： 本专利技术构建的重组短小芽抱杆菌pulA/pSVEB/Brevibacillusbrevis在TM培养 基中发酵48h，酶活为48. 5U/mL。采用本专利技术提供的培养基和培养方法，摇瓶发酵48h，酶活 可达531. 5U/mL;3L罐发酵72h，酶活可达988. 5U/mL。本专利技术还具有发酵原料低廉，发酵调 控简单等优点，适合普鲁兰酶在工业生产中应用。【附图说明】 图1产普鲁兰酶重组短小芽孢杆菌摇瓶发酵上清SDS-PAGE凝胶电泳图；1，发酵上 清液;M，标准蛋白分子量； 图2不同碳源对重组菌生长和产酶的影响；普鲁兰酶活力（白色），菌体干重（黑 色）； 图3不同氮源对重组菌生长和产酶的影响；普鲁兰酶活力（白色），菌体干重（黑 色），BE(牛肉浸膏），P0(多聚蛋白胨），YE(酵母粉），PE(蛋白胨），C0(棉籽粉），AC(酸 水解酪蛋白）； 图4不同金属离子对重组菌生长和产酶的影响；普鲁兰酶活力（白色），菌体干重 (黑色）； 图5重组菌产普鲁兰酶的3L罐分批发酵曲线；菌体干重（?）、普鲁兰酶活力 (); 图6重组菌产普鲁兰酶的3L罐本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产普鲁兰酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌以短小芽孢杆菌为宿主，通过重组质粒pulA/pSVEB表达来源于脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，邹纯，段绪果，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32