一种提高芽孢杆菌蛋白表达量的串联启动子制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种提高芽孢杆菌蛋白表达量的串联启动子。采用本发明专利技术提供的P43-PHpaII-PSPO-I串联启动子构建的QC6菌株，其碱性蛋白酶表达量显著高于采用单一启动子P43、PHpaII和PSPO-I构建的QC1、QC2和QC3菌株，甚至比该三株菌的表达量之和还要高70％左右。采用本发明专利技术提供的P43-PHpaII-PSPO-I-PcryIIIA串联启动子构建的QC7菌株，其碱性蛋白酶的表达量显著高于采用P43-PHpaII-PSPO-I串联启动子构建的QC6菌株和采用单一启动子PcryIIIA构建的QC4菌株，甚至比该两株菌的表达量之和还高50％左右。上述串联启动子均产生了意料不到的技术效果，能大幅度提升芽孢杆菌的蛋白表达量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种可显著提高芽孢杆菌蛋白表达量的串联启动子及其应用。
技术介绍
芽孢杆菌是一个优良的蛋白质表达宿主，它有安全性高(GenerallyRegardedasSafe,GRAS)，生长周期短，发酵成本低，分泌能力强，无明显的密码子偏好性等显著优点，广泛应用于淀粉酶、蛋白酶、普鲁兰酶、果胶酶等酶制剂的工业化生产。为了降低酶制剂产品的生产成本，提高经济效益，工业用芽孢杆菌表达系统的一个重要要求是蛋白质表达量要高。而提高芽孢杆菌表达水平的一个重要手段是提高目的基因的mRNA水平，常用的方法是采用携带目的基因的高拷贝质粒表达载体，该方法最大的缺点是工业化生产过程中高拷贝质粒表达载体存在丢失现象。为了解决质粒菌株稳定性不好的问题，可以将含有与目的基因可操作连接的单个启动子的表达盒及一个可扩增的筛选标记基因(如抗生素抗性标记基因)整合到芽孢杆菌染色体上，然后通过筛选压力(如抗生素)扩增染色体上的表达盒及筛选标记基因，在染色体上产生多拷贝的表达盒。该方法也存在一些缺点，如通过扩增由单个启动子驱动的基因不可能获得饱和水平的mRNA。而且，染色体上串联多拷贝的表达盒可能不稳定。此外，筛选标记基因很难去除。而另外一个获得饱和mRNA水平的方法是筛选特定启动子。但由于用于芽孢杆菌启动子的数量多，且不同启动子的效果无法预测，所以筛选难度也较大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高芽孢杆菌蛋白表达量的串联启动子，是使用来源于芽孢杆菌的启动子P43、PHpaII和PSPO-I，可显著提高芽孢杆菌对外源蛋白的表达量，从而弥补现有技术的不足。本专利技术一方面提供一种串联启动子，包含有启动子P43、PHpaII和PSPO-I；其中，所述启动子P43的核苷酸序列为SEQIDNO：2；所述启动子PHpaII的核苷酸序列为SEQIDNO：3；所述启动子PSPO-I的核苷酸序列为SEQIDNO：4；上述的启动子，是由启动子P43、PHpaII和PSPO-I依次连接而成的，其核苷酸序列为SEQIDNO：7；为了获得更好的效果，上述的串联启动子，还包含启动子PcryIIIA。所述启动子PcryIIIA的核苷酸序列为SEQIDNO：5。所述的串联启动子，由启动子P43、PHpaII、PSPO-I和PcryIIIA依次连接而成，其核苷酸序列为SEQIDNO：8。本专利技术还提供了一种重组质粒，包含上述串联启动子。本专利技术还提供了一种宿主菌，包含上述重组质粒。所述宿主菌为芽孢杆菌。所述宿主菌优选枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。所述宿主菌在生产蛋白酶中的应用。采用本专利技术提供的P43-PHpaII-PSPO-I串联启动子构建的QC6菌株，其碱性蛋白酶表达量显著高于采用单一启动子P43、PHpaII和PSPO-I构建的QC1、QC2和QC3菌株，甚至比该三株菌的表达量之和还要高70％左右，产生了意料不到的技术效果，能大幅度提升芽孢杆菌的蛋白表达量。采用本专利技术提供的P43-PHpaII-PSPO-I-PcryIIIA串联启动子构建的QC7菌株，其碱性蛋白酶的表达量显著高于采用P43-PHpaII-PSPO-I串联启动子构建的QC6菌株和采用单一启动子PcryIIIA构建的QC4菌株，甚至比该两株菌的表达量之和还高50％左右，从而说明P43、PHpaII、PSPO-I和PcryIIIA这四个启动子的串联组合产生了意料不到的技术效果，能大幅度提升芽孢杆菌的蛋白表达量。附图说明图1为pDG1662质粒图谱；图2为pQSXG-1质粒图谱；图3为pQSXG-2质粒图谱；图4为pQSXG-3质粒图谱；图5为pQSXG-4质粒图谱；图6为pQSXG-5质粒图谱；图7为pQSXG-6质粒图谱；图8为pQSXG-7质粒图谱；图9为pQSXG-8质粒图谱；图10为pQSXG-9质粒图谱；图11为采用不同启动子的整合表达菌株发酵酶活水平。具体实施方式申请人通过对现有启动子进行大量筛选和串联组合后发现有些单一启动子对芽孢杆菌的蛋白表达有明显的促进作用，而有些单一启动子则没有显著效果；两个或多个启动子的串联组合对芽孢杆菌蛋白表达量的影响也无法预测，有些启动子串联后对芽孢杆菌的蛋白表达有明显的促进作用，其促进效果甚至远远高于其所包含的单一启动子的效果之和，而有些启动子串联后的促进效果却不如其包含的单一启动子的效果；而且，)串联启动子中各单一启动子的串联顺序对其效果有很大的影响，各启动子只有采用特定的顺序进行串联才能发挥最好的效果，反之，其效果较差。经过长期的研究，申请人筛选到两种可应用于芽孢杆菌的串联启动子P43-PHpaII-PSPO-I和P43-PHpaII-PSPO-I-PcryIIIA，这两种串联启动子对芽孢杆菌的蛋白表达有明显的促进作用，采用该串联启动子构建的芽孢杆菌，其碱性蛋白酶表达量远高于分别采用其包含的单一启动子构建的芽孢杆菌的表达量之和，取得了意料不到的技术效果，从而促成本专利技术。下面结合实例对本专利技术的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，实现本专利技术的方法不应限于本专利技术实施例所记载的具体方法步骤。实施例1采用P43启动子构建的整合表达菌株BacillussubtilisQC1引物1：CGTACGGGATCCGCTGTTTGCGTTTTTGCCGTG(BamHI)引物2：ATTTTCCCCAACGGTTTCTTCATTATCACTTTATATTATAAACA引物3：TGTTTATAATATAAAGTGATAATGAAGAAACCGTTGGGGAAAAT引物4：GTTTTATTTGATGCCTGGCAGTTAGCGTGTTGCCGCTTCTGC引物5：GCAGAAGCGGCAACACGCTAACTGCCAGGCATCAAATAAAAC引物6：CGTACGAAGCTTGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAG(HindIII)以合成的含SEQIDNO:2序列的质粒为模板，利用引物1、引物2扩增P43启动子。利用引物3、引物4扩增碱性蛋白酶基因aprE(SEQIDNO:1)。以大肠杆菌DH5α(Escherichiaco本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种串联启动子，其特征在于，所述的串联启动子包含有启动子P43、PHpaII和PSPO‑I。

【技术特征摘要】
1.一种串联启动子，其特征在于，所述的串联启动子包含有启动子P43、
PHpaII和PSPO-I。
2.如权利要求1所述的串联启动子，其特征在于，所述的启动子P43的核
苷酸序列为SEQIDNO：2。
3.如权利要求1所述的串联启动子，其特征在于，所述的启动子PHpaII
的核苷酸序列为SEQIDNO：3。
4.如权利要求1所述的串联启动子，其特征在于，所述的启动子PSPO-I
的核苷酸序列为SEQIDNO：4。
5.权利要求1所述的串联启动子，其特征在于，所述的串联启动子还包含
启动子PcryIIIA；所述启动子PcryIIIA的核苷酸序列为SEQIDNO：5。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐建，石增秀，徐玉婷，郭小飞，张晓舟，王华明，刘鲁民，黄亦钧，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37