具有定制特征的转基因动物制造技术

本发明专利技术公开了用于创建具有定制特征的动物的材料与方法。在本发明专利技术的原理证明中，使用角蛋白-14特异性启动子、loxp盒中的红荧光蛋白、色素盒中的显性黑（△G23）β防御素 103及SV40（带有内含子）多聚腺苷酸化序列。当Cre重组酶（或HTNCre）以载体形式（例如脂质双层）施用到动物皮肤上时，动物毛皮被永久地遗传修饰而在施加HTNCre的地方变为黑色形状。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 相关申请的交叉引用 本申请是2013年3月15日提交的美国专利申请号为13/837, 405的部分继续申请 案，其中美国专利申请号为13/837, 405的申请是2013年2月15日提交的美国专利申请号 为13/768, 760的申请的部分继续申请案，美国专利申请号为13/768, 760的申请要求2012 年2月15日提交的美国专利申请号为61/598, 987的申请的优先权，其全部内容通过引用 的方式并入本文。 本申请的序列表被标记为SeqList-14Marl3_ST25.txt，其创建于2013年3月14 日且大小为85邸。序列表的全部内容通过引用的引证方式并入本文。
本专利技术设及动物的基因修饰W产生特定特征的可控变化，例如，皮肤和/或皮毛 着色中的变化。
技术介绍
大多数动物物种中合成的唯一色素及所有哺乳动物物种中合成的唯一色素是黑 色素。黑色素分为两类：褐黑素，其产生金色或红色，及真黑素，其产生深栋色或黑色。两种 黑色素都由酪氨酸合成，但其合成途径在多己酿产生后不同。 控制特定的黑素细胞产生褐黑素或真黑素的主要开关是黑素皮质激素受体 (MClR)。MCIR多态性还可能是红色或金色褐黑素的主要决定因素。 黑素皮质激素受体可W通过任何的黑素细胞刺激激素（MSH)激活，最通常的是 曰-M甜，还可W是0-防御素103。相反地，MClR的激活可能通过刺鼠信号蛋白（agouti signalingprotein,AS巧的表达被抑制。0-防御素103信号优于ASP信号且ASP信号优 于MSH信号。此外，所有运些加强或降低其活性的基因中存在突变和多态性。毛色进一步 地由黑色素产生及转运的多个调节剂调节，其包括酪氨酸酶（TYR)、酪氨酸酶转运体0CA2 及泛素基因肥RC2等。 植物产生多种其他色素，包括叶绿素、类胡萝h素、花青素和甜菜红。在运些色素 中，类胡萝h素最容易转移到动物体内，因为植物中类胡萝h素色素的产生依赖于动物中 也能发现的前体。香叶基香叶基焦憐酸是HMG-CoA还原酶途径中的中间体，并用作合成类 固醇和固醇的前体。随着4-5个植物蛋白的添加，香叶基香叶基焦憐酸可替换用作合成胡 萝h素的黄色和澄色或类胡萝h素红色的前体。植物色素转移至动物已发生于自然界：魏 豆晒虫A具有几个从真菌转移的基因。类胡萝h素已在转基因酵母中产生，所述酵母属于 动物界。 在多细胞动物中通过基因干预曾尝试的表面色素的唯一修饰是动物由浅色到深 色或由深色到浅色的不加选择的变化。还未创建更详细的模式。在动物中天然发现的胡萝 h素色素不比晒虫更复杂，且未被设计进入任何多细胞动物中。在本专利技术之前，还未产生动 物物种的皮肤或皮毛的定制颜色或图案。 专利技术简述 本专利技术提供了创建动物中定制特征的材料和方法。例如，本专利技术提供了创建动物 的皮肤和/或皮毛中定制图案的材料和方法。在其他实施方案中，所述定制特征可W包括 动物皮肤或皮毛的长度和/或纹理。可选地，本专利技术还可用于产生动物指甲、爪和/或角的 纹理、结构强度和/或长度的可控变化。 在一个具体的实施方案中，本专利技术的方法包括将基因构建体导入动物的细胞中， 所述基因构建体包括角蛋白-14特异性启动子、Ioxp盒中的红色巧光蛋白、色素盒中的显 性黑（AG23) 0防御素103,及SV40(带有内含子）多聚腺巧酸化序列。当将包括化e重 组酶（或HTNCre)的组合物施用于具有基因构建体的动物皮肤时，施用所述组合物的动物 的皮毛将变黑。W运种方式，所述皮毛被永久地基因修饰而W所需形状转变颜色。 因此，在一个实施方案中，本专利技术提供了在动物的皮肤和/或皮毛中创建定制的 永久图案的方法。 在另一实施方案中，本专利技术提供了在动物物种的皮肤和/或皮毛中产生多颜色图 案的方法。 在进一步的实施方案中，本专利技术提供了在动物物种的皮肤和/或皮毛中创建定制 图案的方法，W使所述动物能继续生长皮毛W在其整个生命期保持运些颜色。 本专利技术还提供了创建定制的预定义的条纹图案的方法，所述图案在该动物中是可 遗传的。 在一个实施方案中，本专利技术提供了一个或多个活化因子的经皮施用W引起本专利技术 的转基因动物中的重组和永久的转基因表达。在某些具体的实施方案中，根据本专利技术使 用的活化因子包括，但不限于，重组酶蛋白质、能够诱导重组酶表达的小分子（如，强力霉 素，cumate、蚁皮激素等），能够诱导重组酶表达的病毒，及驱使重组酶表达的核酸（如DNA) 构建体。 在某些实施方案中，所述活化因子可单独地或在载体溶液中（例如，脂质体、溶 剂、含有DMSO的混合物等）施用于动物皮肤的表面。在一个实施方案中，所述活化因子皮 内（如使用纹身针）或皮下施用。 在一个实施方案中，所述转基因动物包含一个或多个外源核酸分子，其包括但不 限于，着色-相关的基因，表皮/毛发特性基因（如控制动物毛发的长度和/或卷曲度的基 因），与指甲/爪或角特性相关的基因（如编码交联角蛋白的核酸分子），及动物细胞中用 于合成和/或表达植物色素的基因。 在某些实施方案中，根据本专利技术使用的启动子包括但不限于，皮肤-特异性启动 子（例如，角蛋白特异性启动子），黑素细胞特异性启动子（例如，MCR启动子），组成型启 动子（例如，P-球蛋白启动子、CMV启动子），及响应循环因子（如NF-kB、干扰素丫、雌激 素和糖皮质激素类）的启动子。 在某些实施方案中，本专利技术提供了多种类型重组酶祀标的用途W允许通过施用不 同重组酶选择性地特异性激活不同基因。在一个实施方案中，多元重组酶祀标用于允许动 物出生后产生多种颜色。 在一个实施方案中，在具有天然金色皮毛的转基因狗中，化e重组酶激活黑色狗皮 毛的产生，且Flp重组酶激活红色狗皮毛的产生。 在一个实施方案中，本专利技术提供了自身启动子的用途W在不需要外源活化因子时 引起表皮着色。在一个具体实施方案中，自身启动子设及动物发育中限定体节边界。 在一个实施方案中，自身异源启动子用于创建不同物种的表皮图案，如，例如，使 用猫中发现的T油by或Ticked启动子W引起狗的表皮着色。在某些实施方案中，本专利技术提供了具有在出生后永久可定制的表皮图案的转基因 修饰的动物。 在某些实施方案中，本专利技术提供了具有不常发现于哺乳动物中的毛色的转基因修 饰的动物。在某些实施方案中，本专利技术提供了转基因修饰的牛、羊或其他动物，其表皮中长有 永久的识别标志（如编号或条形码）。在某些实施方案中，本专利技术提供了转基因修饰的牛、羊或其他动物，其表皮中具有 "看不见"的标志，其响应健康或生理状况的变化可改变颜色。 在一个实施方案中，所述转基因牛或羊或其他动物可表达表皮或毛皮上的一个 符号，其中如果动物具有NF-kB的慢性激活，所述符号可改变颜色，且如果动物具有干扰 素-T的慢性激活，另一符号可改变颜色。. 在某些实施方案中，本专利技术提供了转基因修饰的动物，其具有出生时本身物种中 不常见的的毛色和图案。 在一个实施方案中，本专利技术提供了黑安格斯品种的转基因牛类动物，其具有白色 或近白色的表皮或毛皮。【附图说明】 图1是用于引起动物中颜色变化的基因构建体的实施方案示意图。 图2是用于创建动物皮肤或毛皮中定制的图案和颜色的基因构建体的实施方案 示意图。 图3是用于创建动物皮肤或毛本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表皮或毛皮具有目的颜色的非人转基因动物的细胞，其中所述转基因动物包含：显性作用的外源核酸分子，其可操作地与启动子连接，其中所述显性作用的外源核酸编码以下蛋白质，所述蛋白质选自参与黑素体组装的蛋白质，参与黑色素合成的蛋白质，参与黑色素转运的蛋白质，和参与黑素细胞产生和/或转移的蛋白质；和/或编码目的序列的外源抑制RNA，其可操作地与启动子连接，其中所述编码目的序列的外源抑制RNA干扰显性作用的野生型动物核酸分子的表达，其中所述野生型核酸分子编码以下蛋白质，所述蛋白质选自参与黑素体组装的蛋白质，参与黑色素合成的蛋白质，参与黑色素转运的蛋白质，参与黑素细胞产生和/或转移的蛋白质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆士·韦斯特，
申请(专利权)人：Ag遗传学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US