本发明专利技术涉及一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法，该方法以枯草芽孢杆菌BSGN6为出发菌株，以木糖诱导型启动子PxylA调控枯草芽孢杆菌中葡萄糖激酶编码基因glck表达和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi表达，控制glck和pgi基因的适度表达，从而提高重组枯草芽孢杆菌中乙酰氨基葡萄糖产量，使得乙酰氨基葡糖的产量大大提高，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明专利技术的构建方法简单，易于操作，所构建的重组枯草芽孢杆菌可大大提高乙酰氨基葡萄糖的产量，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及遗传工程领域，尤其涉及一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法。
技术介绍
乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛添加在药物和营养膳食中来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，然而，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为GRAS(Generally Regarded as Safe)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级乙酰氨基葡萄糖的有效途径。启动子作为基因工程的工具，在菌株的代谢工程改造中具有重要作用。研究表明，关键基因的过量表达有时会给菌体本身带来压力，而基因的适度表达往往会取得更好的效果。葡萄糖激酶编码基因glck和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi是枯草芽孢杆菌中乙酰氨基葡萄糖合成途径的关键基因，在枯草芽孢杆菌基因组上实现乙酰氨基葡萄糖合成途径关键基因启动子的精细调控对进一步提高乙酰氨基葡萄糖合成效率与细胞生长性能具有现实意义。鉴于上述原因，本专利技术人人积极加以创新研究，以期创建一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，使其具有产业上的利用价值。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法。本专利技术的构建方法简单，便于操作，所构建的重组枯草芽孢杆菌通过控制glck和pgi基因的适度表达能够高产乙酰氨基葡萄糖，在代谢工程上具有良好的应用前景。在一方面，本专利技术提供了一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，其由木糖诱导型启动子PxylA调控枯草芽孢杆菌中的葡萄糖激酶编码基因glck表达和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi表达得到。在一具体实施例中，本专利技术的高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌由木糖诱导型启动子PxylA替代枯草芽孢杆菌中的葡萄糖激酶编码基因glck启动子序列和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi启动子序列而得到。进一步的，葡萄糖激酶编码基因glck如NCBI-Gene ID:938206所示。进一步地，磷酸葡糖异构酶编码基因pgi如NCBI-Gene ID:937165所示。在另一具体实施例中，木糖诱导型启动子PxylA调控glck和pgi表达所使用的枯草芽孢杆菌为BSGN6，BSGN6是以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达而得到。枯草芽孢杆菌BSGN6的构建方法可参阅文献“Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production(Metabolic Engineering，23(2014)p42-52)”，在此不作进一步描述。在另一方面，本专利技术还公开了一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：(1)构建包括木糖诱导型启动子PxylA的葡萄糖激酶编码基因glck启动子替换框，通过同源重组将glck启动子替换框中的木糖诱导型启动子PxylA替换枯草芽孢杆菌中的葡萄糖激酶编码基因glck启动子序列；及(2)构建包括木糖诱导型启动子PxylA的磷酸葡糖异构酶编码基因pgi启动子替换框，通过同源重组将pgi启动子替换框中的木糖诱导型启动子PxylA替代步骤(1)中得到的枯草芽孢杆菌中的磷酸葡糖异构酶编码基因pgi启动子序列，得到高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。在一具体实施例中，在步骤(1)中，葡萄糖激酶编码基因glck启动子替换框还包括博来霉素抗性基因zeo，通过同源重组将glck启动子替换框中的博来霉素抗性基因zeo和木糖诱导型启动子PxylA替换枯草芽孢杆菌中的葡萄糖激酶编码基因glck启动子序列，使葡萄糖激酶编码基因glck在木糖诱导型启动子PxylA下调控表达；并向枯草芽孢杆菌中转化质粒pDG148，促使其表达环化重组酶，以消除博来霉素抗性基因zeo。在另一具体实施例中，在步骤(2)中，磷酸葡糖异构酶编码基因pgi启动子替换框还包括博来霉素抗性基因zeo，通过同源重组将pgi启动子替换框中的博来霉素抗性基因zeo和木糖诱导型启动子PxylA替代步骤(1)中得到的枯草芽孢杆菌中的磷酸葡糖异构酶编码基因pgi启动子序列，使葡萄糖激酶编码基因glck和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi均在木糖诱导型启动子PxylA下调控表达；并向枯草芽孢杆菌中转化质粒pDG148，促使其表达环化重组酶，以消除所述博来霉素抗性基因zeo，得到高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌。在又一具体实施例中，上述构建方法中所使用的枯草芽孢杆菌为BSGN6，BSGN6是以B.subtilis 168ΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔldhΔpta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达而得到。枯草芽孢杆菌BSGN6的构建方法可参阅文献“Modular pathway engineering of Bacillus subtilis for improved N-acetylglucosamine production(Metabolic Engineering，23(2014)p42-52)”，在此不作进一步描述。在又一方面，本专利技术还提供了一种上述高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌制备乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，加入诱导剂进行发酵培养，得到乙酰氨基葡萄糖。在一具体实施例中，种子在35-37℃下在种子培养基中活化，活化后的种子在35-37℃下发酵培养。进一步地，上述种子培养基包括以下成分：蛋白胨，酵母粉，氯化钠。在一具体实施例中，种子培养基以其总重量为基准，由以下成分配制而成：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化钠。进一步地，上述发酵培养基包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙和微量元素溶液。在一具体实施例中，发酵培养基以其总重量为基准，包括以下成分：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸铵、12.5g/L磷酸氢二钾、2.5g/L磷酸二氢钾、5g/L碳酸钙和10ml/L微量元素溶液。进一步的，微量元素溶液包括：硫酸锰、氯化钴、钼酸钠、硫酸锌、氯化铝、氯化铜、硼酸和盐酸。更进一步地，微量元素溶液以其总重量为基准，包括以下成分：1.0g/L硫酸锰、0.4g/L氯化钴、0.2g/L钼酸钠、0.2g/L硫酸锌、0.1g/L氯化铝、0.1g/L氯化铜、0.05本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：由木糖诱导型启动子PxylA调控枯草芽孢杆菌中的葡萄糖激酶编码基因glck表达和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi表达得到。
【技术特征摘要】
1.一种高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：由木糖诱导型启动子PxylA调控枯草芽孢杆菌中的葡萄糖激酶编码基因glck表达和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi表达得到。2.根据权利要求1所述的高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：由木糖诱导型启动子PxylA替代枯草芽孢杆菌中的葡萄糖激酶编码基因glck启动子序列和磷酸葡糖异构酶编码基因pgi启动子序列而得到。3.根据权利要求1或2所述的高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述葡萄糖激酶编码基因glck如NCBI-Gene ID:938206所示，所述磷酸葡糖异构酶编码基因pgi如NCBI-Gene ID:937165所示。4.根据权利要求1或2所述的高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所使用的枯草芽孢杆菌通过以B.subtilis 168Δ nagPΔ gamPΔ gamAΔ nagAΔ nagBΔ ldhΔ pta::lox72为宿主，分别以启动子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重组表达而得到。5.根据权利要求4所述的高产乙酰氨基葡萄糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：通过pP43-GNA1质粒游离表达GNA1基因，通过pM7Z6M-PxylA-glmS质粒整合表达glmS基因。6.一种如权利要求1-5中任一项所述的高产乙酰氨基...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，顾洋，邓洁莹，陈坚，堵国成，李江华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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