一种用于减肥降脂的转化体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种用于减肥降脂的转化体，该转化体是由人胃泌酸调节素基因与乳酸乳球菌基因组中胸甘酸合成酶基因发生重组并替换获得，其中，所述的重组替换是指人工化学合成基因序列，使人胃泌酸调节素基因的两端含有乳酸乳球菌基因组中胸苷酸合成酶基因两端的同源序列，并将基因片段电转进乳酸乳球菌中，发生同源重组获得。本发明专利技术转化体是基因组组成型表达胃泌酸调节素，不含有抗性基因，能安全有效地减重、降脂和降血糖，可以用于制备治疗肥胖、糖尿病及脂代谢紊乱的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种用于减肥降脂的转化体及其构建方法与应用。
技术介绍
肥胖是当今世界倍受关注的一个健康问题。欧美发达国家，超过半数的人体重超标，其中的20～30％是肥胖患者。肥胖不仅影响行动和生活质量，并且可引发心血管疾病、2型糠尿病和肾脏疾病等一系列疾病，对人体健康危害极大。调查统计表明，体重指数(body mass index，BMI)每增加1个单位，高血压病的发病风险就增加10％。虽然肥胖的发病原因有多种，遗传、内分泌失调、饮食结构和生活方式等因素都可以诱发肥胖。但是绝大多数肥胖患者属于不良的饮食结构和生活习惯所致的单纯性肥胖。目前，肥胖症的治疗方法主要有饮食行为疗法、药物治疗和手术治疗等。节食和增加运动量等饮食行为疗法减肥效果不好，容易反复，一般人难于长期坚持。手术治疗创伤大，风险高，不易被患者接受。因此，多数肥胖患者倾向于接受药物治疗。目前的减肥药物有化学药物和中草药。其中化学药物一般是通过作用于神经中枢抑制食欲来达到减肥的目的，如芬特明(Phentermine)、芬氟拉明(Dexfenfluramine)和盐酸西布曲明(Sibntramine)等，但是这些药物有导致5-羟色胺综合征，出现精神状态改变(如焦虑不安、躁狂等)副作用，甚至会引发高血压和心绞痛。胰脂肪酶抑制剂奥利司他(orlistat，商品名xenical，赛尼可)也是一种化学减肥药物，可阻断脂肪酶对三酰甘油的水解，抑制脂肪吸收，但有引起脂肪腹泻和导致脂溶性维生素缺乏的副作用。减肥中草药多以植物提取物和膳食纤维为主，主要通过润肠通便、限食促排来达到减肥目的，长期服用会引起营养失衡、水电解质紊乱和乏力等症状。胃泌酸调节素(Oxyntomodulin,OXM)是肠上皮L－细胞分泌的一种短肽肠激素。它由胰高血糖素原(proglucagon)基因编码，转录产物经过多种不同的剪接，可以形成OXM、肠高血糖素(licentin)、胰高血糖素样肽－1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)和GLP-2等多种活性肠肽激素。人OXM含37个氨基酸残基，具有抑制食物吸收和食欲、动员脂肪的作用。OXM的表达与肥胖发病有密切的关系。肥胖患者OXM分泌下降，而厌食症(如热带腹泻，空肠切除术后)OXM的分泌则增加。OXM可以通过三条途径调节
食欲和能量摄取：一是直接作用于胃肠道粘膜上皮细胞GLP-1受体，抑制糖和脂肪的吸收；二是作用于迷走神经，下调胃生长素的分泌，抑制食欲；研究显示，皮下注射OXM可使啮齿动物血液中的胃生长素下降20％，而人类可下降到44％；三是通过甲状腺途径刺激甲状腺素的合成分泌，增加能量消耗，动员脂肪。啮齿动物脑室注射或皮下注射OXM可降低食物吸收和体重，减少脂肪。在英国对26名肥胖患者进行双盲试验，受试者餐前30分钟皮下注射OXM，为期4周。结果显示，治疗组体重减轻了2.3kg，而对照组只减轻了0.5kg，对受试者食性和味觉没有影响。英国的菲亚克斯(Thiakis)公司化学合成了OXM类似肽TKS1225，已进入到临床Ⅲ期研究阶段，美国的惠氏(Wyeth)医药公司出资购买了TKS1225的独占使用权，有望近年内将TKS1225开发成减肥新药。但是，TKS1225等OXM类似肽一般通过化学合成或生物工程生产，产品多为粉针剂，通过注射途径给药。这种生产和给药方式存在生产成本高、体内半衰期短和用药不便的缺点，不易被肥胖患者接受。已授权的中国专利(200910041386.X)—表达人胃泌酸调节素基因的双歧杆菌，虽然在减肥降脂方面已取得很好的效果。但是，此表达系统存在不能成药的重大缺陷。所用质粒载体pBBADs携带氨苄青霉素抗性基因，会在人体内引入氨苄蛋白过敏原。如果长期服用，可能会造成宿主肠道菌群紊乱，也会引起宿主产生耐药性。而本专利使用的乳酸乳球菌株不含有抗生素基因，是一个全新的药物构成，不会引入外来过敏原，生物安全性高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种用于减肥降脂的转化体，该转化体具有更高的人胃泌酸调节素表达量，且不含抗生素，对人体更加安全。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述转化体的构建方法。本专利技术最后要解决的技术问题是提供上述转化体的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种用于减肥降脂的转化体，该转化体是通过将经密码子优化的人胃泌酸调节素基因通过同源重组替换乳酸乳球菌胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，thyA)基因得到。其中，所述的人OXM基因，其核酸序列可在不改变其编码的氨基酸序列的前提下，根据所选宿主的偏好密码子对其核酸序列进行优化调整，使人胃泌酸调节素基因在转化体中提高人胃泌酸调节素表达量，优选的其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。其中，所述的乳酸乳球菌为L.lactis NZ9000、L.lactis NZ3900或L.lactis MG1363上述用于减肥降脂的转化体的构建方法，该方法包括如下步骤：(1)将乳酸乳球菌thyA基因上游序列、经密码子优化的人胃泌酸调节素基因、乳酸乳球菌thyA基因下游序列依次拼接，人工化学合成整个基因片段；(2)将新构建的重组基因片段用电转化进入乳酸乳球菌进行同源重组，筛选出thyA-OXM+菌株。本专利技术是利用人OXM基因与乳酸乳球菌thyA基因同源重组，从而替换掉乳酸乳球菌基因组中的thyA基因，使人胃泌酸调节素可以在乳酸乳球菌中组成型表达。上述用于减肥降脂的转化体在制备减肥降脂药品和食品中的应用也在本专利技术的保护范围之内。其中，所述的药品为口服液、活菌粉剂、片剂或胶囊口服药，所述的食品为固体食品或者饮料。上述用于减肥降脂的转化体在制备肥胖病人降血糖药物中的应用也在本专利技术的保护范围之内。其中，所述的药品为口服液、活菌粉剂、片剂或胶囊口服药。上述用于减肥降脂的转化体在制备脂肪肝病人降脂药物中的应用也在本专利技术的保护范围之内。其中，所述的药品为口服液、活菌粉剂、片剂或胶囊口服药。本专利技术的突出特点是利用乳酸乳球菌能在肠道内长期生长、定植的特性，通过基因同源重组，筛选获得组成型表达胃泌酸调节素的乳酸菌，发挥胃泌酸调节素调节食欲和能量吸收、减肥降脂的生物学作用。此法不需要进行胃泌酸调节素多肽的分离和纯化，生产工艺简单、成本低，可以口服，用药方便，克服了化学合成或基因工程生产胃泌酸调节素类似肽生产成本高、用药不便的缺点。有益效果：本专利技术与现有技术相比，具有如下优势：1、本专利技术制备了组成型表达人OXM的乳酸乳球菌，而且是胸腺嘧啶营养缺陷型菌株。因为胸腺嘧啶(thymidine)是乳酸乳球菌生长所必须的营养成份，当基因组中缺失thyA基因，将不能提供胸腺嘧啶。所以，改造后的乳酸菌不能在外界环境中繁殖生长，对环境不存在任何污染，也不会对环境中的其他微生物产生影响。2、本专利技术构建的菌株不涉及任何对人体和环境有害的元素，包括抗生素、质粒以及可能产生毒性蛋白的基因等，因此可以安全用于人体。中国专利200910041386.X专利技术的表达OXM的转基因双歧杆菌含有氨苄青霉素抗性基因，人长期服用会导致耐药性，
而且这种菌株随粪便排出体外后，会与环境中的其他菌株发生重组，导致产生“超级菌”的可能性增大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于减肥降脂的转化体，其特征在于，该转化体是通过将经密码子优化的人胃泌酸调节素基因替换乳酸乳球菌胸苷酸合成酶基因得到的重组乳酸乳球菌。

【技术特征摘要】
1.一种用于减肥降脂的转化体，其特征在于，该转化体是通过将经密码子优化的人胃泌酸调节素基因替换乳酸乳球菌胸苷酸合成酶基因得到的重组乳酸乳球菌。2.根据权利要求1所述的用于减肥降脂的转化体，其特征在于，所述的经密码子优化的人胃泌酸调节素基因，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。3.根据权利要求1所述的用于减肥降脂的转化体，其特征在于，所述的乳酸乳球菌为L.lactis NZ9000、L.lactis NZ3900或L.lactis MG1363。4.权利要求1所述的用于减肥降脂的转化体的构建方法，其特征在于，该...

【专利技术属性】
技术研发人员：林艳，向荣，赵子建，李芳红，
申请(专利权)人：南京华贞生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32