大肠杆菌工程菌及其催化马来酸合成富马酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种可高产富马酸的大肠杆菌工程菌，通过敲除大肠杆菌的延胡索酸酶编码基因fumA和fumC，并转化来源于粘质沙雷氏菌的马来酸顺反异构酶基因得到。本发明专利技术还公开了上述大肠杆菌工程菌催化马来酸合成富马酸的方法：发酵培养大肠杆菌工程菌，当OD600达到40‑80时对大肠杆菌工程菌进行高密度诱导表达，将得到的发酵液生化催化马来酸，得到富马酸。本发明专利技术利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌中的fumA和fumC基因，切断其富马酸到L‑苹果酸的代谢通路，然后表达来源于粘质沙雷氏菌的马来酸顺反异构酶，获得的基因工程菌株可高效转化马来酸底物合成高纯度富马酸，几乎不合成L‑苹果酸副产物，为全细胞法催化马来酸生产富马酸的工业化提供依据。

Engineering bacteria of Escherichia coli and method for synthesizing fumaric acid catalyzed by maleic acid

The invention relates to a high yield of fumaric acid by Escherichia coli, knock fumarase gene encoding fumA and fumC in Escherichia coli, maleic acid and transformed from Serratia marcescens CIS trans isomerase gene. The invention also discloses a method for the synthesis of fumaric acid Escherichia coli catalyzed by maleic acid: fermentation of Escherichia coli, when OD600 reached 40 80 of Escherichia coli in high density induced expression of the fermentation broth by biochemical catalysis of maleic acid and fumaric acid obtained. The invention uses the Red homologous recombination knockout fumA gene and fumC gene in Escherichia coli, cut to L malic acid fumaric acid and maleic acid metabolic pathway, expression from Serratia marcescens CIS trans isomerase, gene engineering strain can be obtained efficient conversion of maleic acid substrate for the synthesis of high purity fumaric acid, almost not the synthesis of L malic acid by-products, provide the basis for the whole cell catalytic maleic acid and fumaric acid production industrialization.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及发酵工程和生物催化领域，尤其涉及一种大肠杆菌工程菌及其催化马来酸合成富马酸的方法。
技术介绍
富马酸，又称反丁烯二酸、延胡索酸，是一种天然存在的有机酸。作为一种重要的四碳平台化合物和精细化工产品，富马酸广泛用于食品、医药、化工、涂料、增塑剂等领域。例如，在食品方面，可用作口味纯正的酸味剂、风味增强剂；在医药方面，富马酸铁则广泛应用于治疗人体的小红血球贫血病。目前，工业生产富马酸以化学合成法为主，包括糠醛氧化法和顺丁烯二酸酐异构法等。但是化学合成法需利用石油资源，而石油是不可再生资源，促使生产成本增高，并且还有污染大等缺点。随着技术的发展，以微生物发酵法和酶转化法为主的生物合成法正逐渐取代化学合成法，但是微生物发酵法会产生大量的发酵副产物，不利于产品的分离提纯。酶法有转化率高、产物单一、催化pH单一的优点，是工业生产富马酸很有潜力的方法。粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)来源的马来酸顺反异构酶在室温有较好的稳定性，酶活力也相对其他菌株来源的要高，可用于酶法催化合成富马酸，但是游离酶的热稳定性和环境耐受性比较差、不能重复使用。而全细胞稳定性较高，因为酶被保护在其天然的细胞环境中，而且免去了酶的纯化和下游加工过程，并且能够回收重复利用，生产成本更低，因此利用全细胞作为催化剂生产富马酸更具吸引力。在以含有粘质沙雷氏菌来源的马来酸顺反异构酶的大肠杆菌为宿主菌进行全细胞催化生产富马酸时，会由于延胡索酸酶的存在而导致富马酸被转化成L-苹果酸，降低富马酸的转化率和纯度。延胡索酸酶是TCA循环中的一个关键酶，催化富马酸生成L-苹果酸，原核生物中有三种延胡索酸酶，分别由fumA、fumB、fumC编码。fumA在有氧条件下表达；fumB主要在无氧条件下表达；fumC是备用酶，仅有少量表达。因此，需要敲除宿主菌中的fumA和fumC基因以提高富马酸产物的转化率和纯度。鉴于上述缺陷，本专利技术人积极加以研究创新，以期创建一种大肠杆菌工程菌及其催化马来酸合成富马酸的方法，使其更具有产业上的利用价值。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种大肠杆菌工程菌及其催化马来酸合成富马酸的方法。本专利技术利用Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)中fumA和fumC基因，并表达来源于粘质沙雷氏菌的马来酸顺反异构酶，最终获得的基因工程菌可高效转化马来酸底物合成高纯度富马酸。本专利技术的可高产富马酸的大肠杆菌工程菌，工程菌通过敲除大肠杆菌的延胡索酸酶编码基因，并在所得的重组菌株中表达马来酸顺反异构酶基因得到。进一步的，延胡索酸酶编码基因为fumA和fumC。进一步的，马来酸顺反异构酶基因来源于粘质沙雷氏菌。进一步的，大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或野生型大肠杆菌。进一步的，马来酸顺反异构酶基因的表达载体为pET24a系列表达载体、pUC19系列载体、pBR322系列载体、pKK223-3系列载体、pPL451系列表达载体或pBV220载体。本专利技术的可高产富马酸的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括以下步骤：(1)以pKD13质粒为模板，并设计延胡索酸酶编码基因fumA和fumC的引物，进行聚合酶链式反应，得到延胡索酸酶编码基因fumA和fumC线性同源重组片段；(2)将表达Red重组酶的载体质粒转入大肠杆菌中制备感受态细胞，感受态细胞经阿拉伯糖诱导后制备电转感受态细胞；(3)将步骤(1)得到的线性同源重组片段电转化进入步骤(2)中的电转感受态细胞中，进行同源重组，得到突变的大肠杆菌；(4)去除步骤(3)得到的突变的大肠杆菌中的载体质粒，然后向其中转化辅助质粒以消除抗性基因，再去除辅助质粒，得到敲除fumA和fumC基因的大肠杆菌；(5)将马来酸顺反异构酶表达载体电转化入步骤(5)得到的敲除fumA和fumC基因的大肠杆菌，得到大肠杆菌工程菌。进一步的，在步骤(1)中，延胡索酸酶编码基因fumA和fumC引物序列分别如SEQ ID:1和SEQ ID:2所示。进一步的，在步骤(1)中，延胡索酸酶编码基因fumA和fumC引物命名为FumApKD3R和FumCpKD3F。进一步的，在步骤(1)中，线性同源重组片段的中间为卡那抗性基因和FRT标记、两侧为短同源臂。进一步的，在步骤(2)中，载体质粒为pKD46。进一步的，在步骤(2)中，大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)。进一步的，在步骤(2)中，阿拉伯糖的浓度为2-10mmol/L。进一步的，在步骤(2)中，诱导ParaB启动子表达α、β和γ蛋白后得到宿主电转感受态。进一步的，在步骤(3)中，用引物YfumCF和YfumAR进行菌落PCR验证，以确定得到突变的大肠杆菌。进一步的，YfumCF和YfumAR引物序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。进一步的，在步骤(4)中，辅助质粒为pCP20。进一步的，在步骤(4)中，用引物YfumCF和YfumAR进行菌落PCR验证，以确定得到抗性基因的缺失突变。进一步的，YfumCF和YfumAR引物序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。进一步的，在步骤(4)中，采用42℃热激偶合抗生素抗性负筛选去除载体质粒和辅助质粒。进一步的，在步骤(5)中，马来酸顺反异构酶表达载体为pET24a-maiA。进一步的，pET24a-maiA载体质粒为文章“粘质沙雷氏菌马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质”(王亚，等，食品与生物技术学报,2014,33(11):1024-1029)中所构建的。进一步的，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)来源的马来酸顺反异构酶在室温有较好的稳定性，酶活力也相对其他菌株来源的要高。本专利技术还公开了上述大肠杆菌工程菌催化马来酸合成富马酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：对大肠杆菌工程菌进行发酵培养，当OD600达到40-80时对大肠杆菌工程菌进行高密度诱导表达，将得到的发酵液生化催化马来酸，得到富马酸。进一步的，使用乳糖作为诱导剂进行高密度诱导表达。进一步的，高密度诱导表达的条件为：温度为25℃-37℃，乳糖流加速度为0.15-0.25g/L h，pH 7.0-7.2。进一步的，高密度诱导表达的条件为：溶氧20％-40％，通气量1.25-2vvm，比生长速率μ为0.15-0.25 1/h。进一步的，发酵过程采用指数流加补料，指数流加补料使用的补料培养基包括以下重量的各组分：甘油200-600g/L，硫酸镁5-8g/L，蛋白胨2-4g/L，酵母膏2-4g/L。进一步的，本专利技术的补料培养基可提高马来酸顺反异构酶的表达效率。进一步的，诱导表达过程采用浓度为100-200g/L的乳糖。进一步的，发酵过程中将乳糖流加到发酵液中。进一步的，发酵培养基的成分包括：蛋白胨1-2g/L，酵母粉1-2g/L，甘油8-10g/L，磷酸二氢钾10-15g/L，磷酸氢二铵1-5g/L，柠檬酸1-2g/L，硫酸镁1.68-3.36g/L，微量元素10mL。进一步的，微量元素包括：硫酸亚铁1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可高产富马酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述工程菌通过敲除大肠杆菌的延胡索酸酶编码基因，并在所得的重组菌株中表达马来酸顺反异构酶基因得到。

【技术特征摘要】
1.一种可高产富马酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述工程菌通过敲除大肠杆菌的延胡索酸酶编码基因，并在所得的重组菌株中表达马来酸顺反异构酶基因得到。2.根据权利要求1所述的可高产富马酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述延胡索酸酶编码基因为fumA和fumC。3.根据权利要求1所述的可高产富马酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述马来酸顺反异构酶基因来源于粘质沙雷氏菌。4.根据权利要求1所述的可高产富马酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌为Escherichia coli BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、JM109、DH5α、TOP10、HB101、DH10B或野生型大肠杆菌。5.根据权利要求1所述的可高产富马酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述马来酸顺反异构酶基因的表达载体为pET24a系列表达载体、pUC19系列载体、pBR322系列载体、pKK223-3系列载体、pPL451系列表达载体或pBV220载体。6.一种如权利要求1所述的大肠杆菌工程菌催化马来酸合成富马酸的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，刘文茂，周丽，崔文璟，刘中美，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32