本发明专利技术公开了一种构建的重组大肠杆菌及生物合成3'‑唾液乳糖的方法，其名称为E.coli‑XYY，它具有3'‑唾液乳糖的合成途径，同时也公开了构建的方法。本发明专利技术同时克服了现有的技术难题，获得了一个高效的基因敲除方案；原始菌株在通过基因工程改造以后，除了生产3'‑唾液乳糖外，没有改变菌株的其它特性，不影响发酵生产；该菌株采用的质粒为成熟的大肠杆菌质粒，因此在代谢过程中不影响细菌生长和正常代谢。本发明专利技术构建的重组大肠杆菌具有很好的应用前景，为生物法生成3'‑唾液乳糖提供了新的思路。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用重组大肠杆菌合成3'-唾液乳糖的方法，属于代谢工程领域。
技术介绍
母乳中包含婴儿生长和发育所必须的营养物质，但是它同时也含有传统营养物质中所没有的物质，这些物质对身体是有益的。其中一些物质就是人乳寡糖（HMOs）。唾液乳糖是常见的人乳寡糖，具有抗黏附，维持肠道微生物组成及糖组修饰等功能, 在营养和药用方面，也是很有前途的寡糖。唾液乳糖，如3'-唾液乳糖在糖组修饰方面起着重要的作用，调节肠内上皮细胞表面多糖的表达，调节大多数病原菌和共生菌的黏附位点。暴露在3'-唾液乳糖的情况下，CaCo-2细胞可以改变其细胞表面多糖组成，3'-唾液乳糖是母乳中一种主要的成分。因为暴露在3'-唾液乳糖的情况下，细胞表面α2-3和α2-6连接的唾液酸残基明显的减少。在细菌和宿主相互作用的情况下，为了评估这些细胞表面糖组变化的重要性，Angeloni等对肠道致病性大肠杆菌的黏附是否改变进行了评估。肠道致病性大肠杆菌黏附到宿主肠上皮细胞表面的多糖上。事实上，3'-唾液乳糖在上皮细胞表面糖组中引起了的变化，这种变化导致肠道致病性大肠杆菌的黏附于对照组相比，减少了90%。这些结果表明，低聚糖如3'-唾液乳糖对宿主和细菌的相互作用的调节存在新的机制。另外，据报道，研究表明，含有3'-SL的奶会通过集群梭菌属IV的细菌影响肠内定植。目前，3'-唾液乳糖的生产方法主要为化学法，化学法生产存在诸多弊端，如合成步骤过多，生成的产物较多，副产物复杂，其反应液对环境产生污染等，通过生物法来制备3'-唾液乳糖越来越受到研究者的关注。本专利技术中构建的重组工程菌实现了3'-唾液乳糖的生物合成，为生物法探索生成目标代谢产物提供了新思路。
技术实现思路
本专利技术通过构建一株重组大肠杆菌，实现了从乳糖到3'-唾液乳糖的生物合成。所采取的技术方案如下：本专利技术的第一个目的在于提供了一种利用乳糖合成3'-唾液乳糖的重组大肠杆菌。其特征在于，具有3'-唾液乳糖的合成途径。名称为E.coli-XYY。同时过表达乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB），CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA），N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC），β-半乳糖苷透性酶基因（lacY），唾液酸转移酶基因（lst），并敲除Neu5Ac转运子（nanT），Neu5Ac醛缩酶基因（nanA），N-乙酰甘露糖胺激酶基因（nanK），N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶基因（nanE），葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因（nagB），N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因（nagA）和β-半乳糖苷酶基因（lacZ）。所述CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因neuA，基因登录号GI：7152208; 乙酰神经氨酸合成酶基因neuB，基因登录号GI：7152206；N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC，基因登录号GI：7152210；β-半乳糖苷透性酶基因lacY，基因登录号GI：949083；来源于大肠杆菌。所述唾液酸转移酶基因（lst），基因登录号GI：325207958来源于脑膜炎奈瑟菌。所述具有3'-唾液乳糖合成途径，是指过表达CMP-乙酰神经氨酸合成酶，乙酰神经氨酸合成酶，N-乙酰葡萄糖胺异构酶，β-半乳糖苷透性酶和唾液酸转移酶。本专利技术第二个目的在于提供了大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于步骤如下：1）分别制备含有乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB），CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA），N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC）的重组质粒，含有β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）的重组质粒，含有唾液酸转移酶基因（lst）的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒； 2）将质粒pSim导入转化到宿主菌E.coliBL21（DE3）中，获得携带质粒的宿主菌； 3）以pKD3为模板，分别扩增带有Neu5Ac醛缩酶基因nanA，N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK，N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶基因nanE，葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因nagB，N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA，Neu5Ac转运子nanT基因，β-半乳糖苷酶基因lacZ同源臂的抗性敲除片段；4) 先向步骤2所得的携带质粒pSim的宿主菌中转化同一个基因的抗性敲除片段，获得缺失一个基因的重组菌；5) 将步骤4所得的重组菌进行溶源化处理，利用pCP20质粒进行抗性消除；6) 以步骤5所得的缺失一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤5）的操作，获得缺失两个基因的重组菌，再重复步骤5）的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将步骤3）所述的基因全部敲除，获得缺失7个基因的重组大肠杆菌；7) 将步骤6）中基因敲除的大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤1）所得的代谢途径构建质粒转化到溶源菌中，获得能够利用乳糖合成3'-唾液乳糖的重组大肠杆菌；其中所述构建Neu5Ac醛缩酶基因nanA，N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK，N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶基因nanE，Neu5Ac转运子nanT的缺失引物和鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4 所示；构建葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因nagB，N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA的缺失引物和鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示；构建β-半乳糖苷酶基因lacZ的缺失引物和鉴定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12所示：本专利技术第三个目的在于提供了采用所获得的大肠杆菌基因工程菌E.coli-XYY进行发酵合成3'-唾液乳糖，培养基和发酵方法如下：LB培养基（1L）:Tryptone(胰蛋白胨)：10g，Yeast Extract（酵母提取物）：5g，NaCl（氯化钠）：5g。若配置固体培养基，则再加入15g Agar（琼脂）。M9培养基（1L）：Na2HPO4·7H2O（七水合磷酸氢二钠）：12.8g，KH2PO4（磷酸二氢钾）3g，NaCl（氯化钠）：0.5g，NH4Cl（氯化铵）2g，MgSO4·7H2O（七水合硫酸镁）0.25g，Yeast Extract（酵母提取物）2g，Glycerol（甘油）：20g。将所得基因工程菌在5mL含有卡那霉素50 μg/ml，氨苄青霉素100 μg/ml，链霉素50 μg/ml的LB培养基中37℃，220rpm/min培养12h，转入M9培养基，M9培养基在使用前加入卡那霉素，氨苄青霉素，链霉素（卡那霉素50 μg/ml，氨苄青霉素100 μg/ml，链霉素50 μg/ml），37℃，培养月3h左右，加入IPTG（IPTG 0.2mM）,并转入25℃培养，培养约2h后，加入乳糖，继续培养4h后，取样。该方法的具体步骤如下：1）制备含有乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB），CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA），N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC），β-半乳糖苷透性酶基因（lacY），唾液酸转移酶基因（lst）的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒；2）将质粒pSim导入转化到宿主菌E.coli BL21（DE3）中，获得携带质粒的宿主菌；3）分别构建Neu5Ac醛缩酶基因nanA，N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种催化乳糖合成3'‑唾液乳糖的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于具有3'‑唾液乳糖的合成途径，基因工程菌名称为E.coli‑XYY。
【技术特征摘要】
1.一种催化乳糖合成3'-唾液乳糖的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于具有3'-唾液乳糖的合成途径，基因工程菌名称为E.coli-XYY。2.一种权利要求1所述催化乳糖合成3'-唾液乳糖的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行：1）分别制备含有乙酰神经氨酸合成酶基因（neuB），CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因（neuA），N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因（neuC）的重组质粒，含有β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）的重组质粒，含有唾液酸转移酶基因（lst）的重组质粒，获得构建代谢途径的质粒；2）将质粒pSim导入转化到宿主菌E.coli BL21（DE3）中，获得携带质粒的宿主菌；3）以pKD3为模板，分别扩增带有Neu5Ac醛缩酶基因nanA，N-乙酰甘露糖胺激酶基因nanK，N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶基因nanE，葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶基因nagB，N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰酶基因nagA，Neu5Ac转运子nanT基因，β-半乳糖苷酶基因lacZ同源臂的抗性敲除片段；4) 先向步骤2所得的携带质粒pSim的宿主菌中转化同一个基因的抗性敲除片段，获得缺失一个基因的重组菌；5) 将步骤4所得的重组菌进行溶源化处理，利用pCP20质粒进行抗性消除；6) 以步骤5所得的缺失一个基因的重组菌为宿主菌，重复步骤5）的操作，获得缺失两个基因的重组菌，再重复步骤5）的操作，每次操作均以上一次操作获得的重组菌为宿主菌，直至将步骤3）所述的基因全部敲除，获得缺失7个基因的重组大肠杆菌；7) 将步骤6）中基因敲除的大肠杆菌进行溶源化处理，再将步骤1）所得的代谢途径构建质粒转化到溶源菌中，获得能够利用乳糖合成3'-唾液乳糖的重组大肠杆菌。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述构建Neu5Ac醛缩酶基因nan...
【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，黄笛，许莹莹，王茹，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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