重组幽门螺杆菌粘附素保守区的制备及用途制造技术

重组幽门螺杆菌粘附素保守区的制备及用途，ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括：（ａ）序列号１中所示的核苷酸序列，（ｂ）在遗传密码简并性的范围内与（ａ）中序列相应的核苷酸序列，或，（ｃ）在严格条件下与（ａ）或／和（ｂ）的序列杂交的核苷酸序列。本发明专利技术具有运用ＰＣＲ技术克隆幽门螺杆菌粘附素基因，并构建载体对其进行序列分析和蛋白表达分析，提高抗血清可阻止幽门螺杆菌粘附于胃粘膜上皮细胞的优点。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种重组幽门螺杆菌粘附素保守区的制备及用途。
技术介绍
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃腺癌、胃黏膜相关性淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤的发生亦密切相关。此外，血清流行病学研究表明Hp感染与循环、呼吸、胃十二指肠外消化系统疾病以及自身免疫疾病的发生也有关。随着Hp病因地位的上升，对其致病机制的研究亦趋深入，Hp的致病机制包括诸多环节，但尤以其黏附机制最为关键，因为Hp必须首先定植于人胃黏膜才能进一步发挥其致病作用，而黏附又是Hp定植在胃黏膜表面的前提。既然已经发现胃十二指肠溃疡是传染病，治疗目的之一就是用抗生素消除病原体。然而，用各种抗生素(阿莫西林、硝基呋喃、furazolidin红霉素a.o)进行单独治疗已被证实并不令人满意，因为甚至在这种情况下仅有0-15％病例会根除细菌。目前，把酸阻断剂(Ompeprazol)和抗生素(阿莫西林)结合使用达到最成功的治疗效果，这种疗法使清除率达80％(Malfertheiner，1994)。但用抗生素治疗消除幽门螺杆菌并不是有前途的长期治疗方案，因为细菌会迅速产生对抗生素的耐性。迄至已描述了几种有潜力的幽门螺杆菌粘附素，并克隆了编码所谓N-乙酰神经氨基乳粘-结合血凝集素的一种基因(hpaA)并进行测序(Evans等，1993)。它是一种应能识别上皮细胞上含唾液酸的受体的蛋白质。在Hp疫苗的研制过程中，发现目前采用的基因重组抗原尿素酶、细胞空泡毒素、过氧化氢酶等，基本上着眼于阻断Hp的毒力因素，而与Hp定植密切相关的黏附素评价较少。目前文献报道的Hp黏附素较多，其中已经证实的有四种，包括迄今为止唯一明确受体的Hp黏附素BabA，和经体外黏附及其相应抗体的抑制实验证明的黏附素AlpA、AlpB和HopZ；然而这四种黏附素并不是存在于所有菌株中，如BabA存在于CagA致病岛阳性的菌株中，而且它们在不同的菌株中存在一定程度的变异。Harry等早在1998就提出作为Hp疫苗的抗原成分应是保守的，即不是特异的存在与某些菌株中。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种运用PCR技术克隆幽门螺杆菌粘附素基因，并构建载体对其进行序列分析和蛋白表达分析，提高抗血清可阻止幽门螺杆菌粘附于胃粘膜上皮细胞的基因重组幽门螺杆菌粘附素保守区的制备及用途。本专利技术的目的是这样实现的DNA分子，其特征在于，它包括(a)序列号1中所示的核苷酸序列，(b)在遗传密码简并性的范围内与(a)中序列相应的核苷酸序列，或，(c)在严格条件下与(a)或/和(b)的序列杂交的核苷酸序列；和(a)它编码一种能粘附人细胞的多肽，(b)载体含有DNA分子的至少一个拷贝，(c)细胞被载体所转化；及(a)序列号1所示的核苷酸序列，或，(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的核苷酸序列，(c)多肽能粘附人细胞。除了序列号1所示核苷酸序列和在遗传密码简并性范围内与该序列相应的核苷酸序列之外，本专利技术还包括在严格条件下与这些序列之一杂交的DNA序列。本专利技术包括在些洗涤条件下与序列号1所示核苷酸序列之一杂交或与在遗传密码简并性范围内的相应核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本专利技术的DNA分子最好编码能粘附到人细胞上、特别是人胃上皮细胞上的多肽。此外，本专利技术的DNA分子最好在核苷酸水平上与序列号1所示核苷酸序列有至少70％、特别优选至少90％的同源性。而且，该DNA分子的长度最好至少为45个核苷酸，优选至少50个核苷酸。本专利技术的又一个目的是含本专利技术DNA分子的至少一个拷贝的载体。该载体可以是最好在表达信号(启动子、操纵基因、增强子等)控制下本专利技术DNA分子位于其上的任何原核或真核载体。原核体的例子有象噬菌体(例如λ噬菌体)这样的染色体载体以及象质粒这样的染色体外载体，而环状质粒载体是特别优选的。本专利技术的载体也可以是真核载体例如酵母载体或者是适于高等细胞的载体(例如，质粒载体、病毒载体、植物载体)。本专利技术的又一目的是用本专利技术载体转化的细胞。在一优选实施方案中，该细胞是原核细胞、优选革兰氏阴性的原核细胞、特别优选大肠杆菌细胞。不过，另一方面，本专利技术的细胞也可以是真核细胞，例如真菌细胞(如酵母)、动物或植物细胞。本专利技术还涉及由本专利技术DNA分子编码的多肽。该多肽最好能粘附人细胞，并且包括(a)序列号1所示氨基酸序列，或(b)与(a)中序列发生免疫交叉反应的氨基酸序列。本专利技术的多肽最好与序列号1所示核苷酸序列有至少90％的同源性。本专利技术的多肽最好通过下述方法生产用本专利技术的DNA分子或载体转化一种细胞，在多肽能得以表达的条件下培养转化的细胞，从细胞或/和培养物上清液中分离多肽。该方法中可获得融合多肽以及非融合多肽形式的本专利技术多肽。本专利技术的多肽也可用作免疫原来产生抗体。因此，本专利技术还涉及抗本专利技术多肽的抗体。本专利技术另一方面涉及一种药用组合物，它包含作为活性物质的本专利技术的DNA分子、本专利技术的多肽或本专利技术的抗体，选择性地含有常见药用辅助物质、稀释剂、添加剂和载体。一方面，本专利技术的药用组合物可用于诊断幽门螺杆菌感染。另一方面，该药用组合物也可用于防止或治疗幽门螺杆菌感染。对治疗应用而言，将多肽或其片断用于产生主动疫苗，或将抗体用于产生被动疫苗。本专利技术具有运用PCR技术克隆幽门螺杆菌粘附素基因，并构建载体对其进行序列分析和蛋白表达分析，提高抗血清可阻止幽门螺杆菌粘附于胃粘膜上皮细胞和提高免疫原性及活性高和粘附功能高等优点。设计CB特异引物，通过DNA重组技术获得四种(BabA)、AlpA、AlpB和HopZ的蛋白序列，黏附素保守区的结构基因，并对其进行生物信息学分析，进一步表达保守区基因。构建了四种黏附素共同保守区的重组质粒，测序显示CB基因长588bp；该基因编码195个氨基酸，与四种黏附素保守区的同源性均达50％以上，蛋白质分子量约为22.5KD，显示出了良好的抗原性和疏水性。分析了836767个序列，与其同源性达40％的均匀为Hp序列。蛋白电泳分析结果发现，经诱导后高效表达相对分子量为22 500的蛋白，与预期分子量大小一致，凝胶自动扫描分析，其重组黏附素保守区蛋白占菌体总蛋白的29.6％，其中可溶性表达占上清的21.9％，包涵体占沉淀的72.6％。体外及动物实验表明幽门螺杆菌四种黏附素保守区CB是安全的，无或较少有导致人外周血T淋巴细胞凋亡作用；具有生物活性，能促进幽门螺杆菌感染患者外周血淋巴细胞增殖，白细胞介素4水平的升高，从而提高患者清除幽门螺杆菌的免疫能力；具有免疫原性，可使小鼠产生相应抗体(包括IgA和IgG)，其抗血清可阻止幽门螺杆菌对于人胃黏膜上皮细胞的黏附，可用于预防和治疗幽门螺杆菌感染。表达幽门螺杆菌CB的减毒鼠伤寒沙门氏菌口服疫苗的免疫治疗作用的小鼠实验表明其可显著提高小鼠脾脏淋巴细胞CD4/CD8的比值，小肠液中可检测大量分泌性特特异抗CB-IgA抗体，其4周根除率为53.3％，且无毒、副作用。附图说明图1是本专利技术的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，图2是本专利技术的重阻质粒PET-226(+)/CB的双酶鉴定图谱，图3是本专利技术的CB重组蛋白的SDS-PAGE分析图，图4是序列表。具体实施例方式下面将结合附图和实施例对本专利技术的作进一步的详述如图1～3所本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括：（ａ）序列号１中所示的核苷酸序列（ｂ）在遗传密码简并性的范围内与（ａ）中序列相应的核苷酸序列，或（ｃ）在严格条件下与（ａ）或／和（ｂ）的序列杂交的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：白杨，张亚历，王继德，张振书，周殿元，
申请(专利权)人：南方医院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]